本文選題：嵌合體肝臟　切入點：山羊　出處：《昆明醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：[目的]建立同種異體山羊嵌合體肝臟,為研究間充質干細胞體內生存演變規(guī)律、免疫耐受形成機制和開展肝臟疾病研究提供實驗動物模型。[方法]1.山羊骨髓間充質干細胞(BMMSC)的分離、鑒定:無菌條件下采集1月齡的雄性羔羊骨髓0.5-lml,通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法分離細胞,采用鏡檢方法觀察細胞形態(tài)特征、流式分析方法鑒定細胞免疫表型、體外誘導方法鑒定細胞分化潛能。2.山羊BMMSC的標記:采用攜帶綠色熒光蛋白基因(GFP)的慢病毒與BMMSC共培養(yǎng)的方法轉染標記BMMSC,測定慢病毒的最佳劑量。3.胎肝內定位注射GFP標記的BMMSC:在B超輔助下建立胎羊肝臟內定位注射GFP標記的BMMSC的技術方法,觀察移植后受體母羊的生活狀態(tài)。4.山羊嵌合體肝臟模型的鑒定:待孕羊分娩后50天,通過手術方法切取新生羔羊部分肝臟組織做以下鑒定分析:(1)GFP陽性細胞觀察:切取羔羊少許肝臟制作冰凍切片,在熒光顯微鏡下觀察肝組織中GFP陽性細胞的存在和分布;(2)HE染色分析:將冰凍切片置于福爾馬林液中固定5min,進行HE染色后,在顯微鏡下觀察GFP陽性細胞分布及病理組織學結構;(3)SRY基因表達鑒定:采集新生羔羊少許肝臟組織,分別提取DNA進行PCR擴增以鑒定SRY基因的表達。(4)GFP陽性細胞比例測定:切取羔羊少許肝臟剪碎后,用新鮮膠原蛋白酶消化,制成肝臟單細胞懸液,應用流式細胞儀檢測分析GFP陽性細胞比例;[結果]1.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法,使用含10%FBS的DMEM/F12懸浮漂洗過的骨髓細胞并靜置培養(yǎng)4-5天后,就可在鏡下觀察到貼壁生長的長梭形細胞或細胞集落,8-12天后可以在鏡下觀察到成片密集排列呈旋渦狀貼壁生長的成纖維細胞樣細胞。取第3代細胞用流式細胞儀檢測,結果為這些細胞高表達CD13、CD29、CD44、CD90、CD105,低表達或者不表達CD3。并可被誘導向脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞分化,由此判斷所獲細胞為BMMSC。2.按0、10、100的MOI加入慢病毒與山羊BMMSC共培養(yǎng),3天后可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光出現(xiàn),表明已經(jīng)成功轉染了 GFP,且MOI為100的轉染組GFP表達明顯較多,即綠色熒光亮度較強,MOI為10的轉染組GFP表達較少,MOI為0的對照組沒有觀察到綠色熒光。將GFP轉染的BMMSC進行傳代培養(yǎng),通過流式細胞術檢測傳代后GFP細胞的表達率,實驗結果顯示1-4 代細胞 GFP 轉染率分別為(42.3±2.25)%、(41.6±2.65)%、(41.4±3.75)%和(38.2±4.75)%,傳代四代內GFP表達率無明顯差異。3.借助B超探查結束,可以準確診斷母羊是否懷孕、胎兒數(shù)量以及發(fā)育狀態(tài)。在B超顯像條件下,可觀察到懷孕母羊腹中不同孕齡的胎羊胎心有節(jié)律性跳動,可以準確確定位于胎心旁邊的胎肝位置,而且一次性注射0.5ml(含106-108)BMMSC到2-4月齡胎肝內,體積合適不會導致流產(chǎn)。4.山羊嵌合體肝臟模型的鑒定:(1)冰凍切片觀察:熒光顯微鏡下可觀察到注射過細胞的肝臟組織中有綠色熒光分布,有的呈規(guī)律的管狀結構,而且注射較多間充質干細胞的羔羊肝組織內有更多的GFP陽性的管狀結構。(2)HE染色觀察:在冰凍切片中GFP陽性細胞所在的同一視野中可以觀察到中央靜脈以及環(huán)繞于其四周的大量肝索、肝血竇等正常肝臟組織學結構,細胞形態(tài)正常。GFP陽性細胞已嵌合在肝組織中并演變?yōu)楦谓M織細胞。同樣,在冰凍切片中觀察到的GFP陽性管狀結構,經(jīng)HE染色觀察證實是典型的膽管,有眾多柱狀上皮細胞密集環(huán)繞呈管狀結構,細胞核呈深藍色,膽管周邊可觀察到典型的匯管區(qū)結構,且沒有明顯的淋巴細胞浸潤。這些結果表明胎肝內定位注射的GFP標記的BMMSC在羔羊出生后50天之內沒有受到免疫細胞影響,嵌合到羔羊肝臟組織中演變?yōu)楦谓M織細胞或膽管柱狀上皮細胞并且形成了膽管結構。(3)SRY基因表達鑒定:采用PCR方法可以在注射過雄性山羊BMMSC分娩產(chǎn)生的新生50天羔羊肝臟組織中檢測到SRY基因的表達情況,包括2只雌性新生羔羊,證實新生羔羊肝臟組織中確實存在雄性山羊供體來源的細胞。(4)GFP陽性細胞比例測定:在注射過細胞的出生50天的新生羔羊肝臟組織中,通過流式細胞技術能檢測到GFP陽性細胞的存在,最少的有2.25%的GFP細胞存在,最多的有7.23%的GFP細胞存在。[結論]1.采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法、用10%FBS-DMEM/F12培養(yǎng)1月齡羔羊骨髓0.5-1ml,可以分離擴增到呈漩渦狀密集排列生長的BMMSC;2.采用攜帶綠色熒光蛋白基因(GFP)的慢病毒與BMMSC共培養(yǎng)的方法可以成功標記間充質干細胞,慢病毒的最佳MOI值為100,標記的細胞傳代4代后GFP的表達率不會顯著降低;3.在超聲引導下,可以實現(xiàn)3月齡的胎山羊肝臟實質區(qū)內BMMSC的定位注射,而且一次性定位注射0.5mlBMMSC(含106個-108個)到2-4月齡胎肝內不會導致母羊流產(chǎn);4.不同月齡的胎肝內定位注射GFP標記的山羊BMMSC,可以形成嵌合體肝臟。在羔羊出生后50天后的肝臟病理組織中可以觀察到GFP陽性細胞的存在或演變?yōu)橹鶢钌掀ぜ毎⑿纬傻哪懝芙Y構。經(jīng)PCR鑒定可以在新生雌性羔羊肝臟組織中檢測到SRY基因的表達,流式細胞技術分析顯示注射肝臟中GFP陽性細胞與BMMSC注射量成正比,表明成功建立了同種異體山羊嵌合體肝臟模型。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R-332;R575

【參考文獻】

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1 陳政;匡喬婷;楊杰;張強;;人臍帶間充質干細胞在活體內轉染方法的優(yōu)化選擇[J];中國普外基礎與臨床雜志;2016年08期

2 張政;王福生;;肝衰竭和肝硬化的干細胞治療[J];肝臟;2013年12期

3 Mukaddes Esrefoglu;;Role of stem cells in repair of liver injury:Experimental and clinical benefit of transferred stem cells on liver failure[J];World Journal of Gastroenterology;2013年40期

4 馮娜;蘇娟;田沛;朱海英;胡以平;;肝臟細胞上皮間質轉化[J];生命的化學;2012年06期

5 張海斌;何志穎;楊廣順;;人源化肝臟嵌合體小鼠的研究進展[J];中華肝臟病雜志;2011年05期

6 劉光澤;周笛;范沛;顧為望;;人鼠肝組織嵌合體模型的制備[J];中國比較醫(yī)學雜志;2010年10期

7 王忠;汪艷;潘明新;孔凡東;高毅;;輸注自體骨髓間充質干細胞對小型豬異基因移植肝的保護作用研究[J];解放軍醫(yī)學雜志;2009年02期

8 潘興華;龐榮清;張步振;王鶴樺;楊勇琴;梁虹;;不同年齡人骨髓間充質干細胞體外生長特性分析[J];生物醫(yī)學工程與臨床;2006年05期

9 孫琪云,劉麗輝,胡鍇勛,范傳波,黃雅靜,邊莉,郭梅,艾輝勝;獼猴造血嵌合體檢測方法的建立與應用[J];中國實驗血液學雜志;2005年04期

10 唐曉文,吳德沛,朱子玲,王瑋,孫愛寧,仇惠英,傅錚錚,常偉榮,阮長耿;嵌合體的動態(tài)定量檢測在異基因造血干細胞移植中的應用[J];中華血液學雜志;2004年02期

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本文編號：1647562