本文選題：短腸綜合征　切入點(diǎn)：糞便菌群　出處：《南京大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：短腸綜合征(shortbowelsyndrome,SBS)是指由于出生缺陷、手術(shù)切除等因素導(dǎo)致腸道有效吸收面積不足,進(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重營(yíng)養(yǎng)不良和水電解質(zhì)紊亂等的一種臨床綜合征。依據(jù)不同的解剖學(xué)類型,SBS可分為空腸造口型(Ⅰ型)、空腸結(jié)腸吻合型(Ⅱ型)和空腸回腸吻合型(Ⅲ型)。大多數(shù)的SBS患者需要依賴腸外營(yíng)養(yǎng)(parenteral nutrition,PN)來維持機(jī)體的能量和營(yíng)養(yǎng)需求,但長(zhǎng)期的腸外營(yíng)養(yǎng)可引起腸衰竭相關(guān)性肝損害(intestinal failure associated liver disease,IFALD)和導(dǎo)管相關(guān)性感染等諸多并發(fā)癥;此外,小腸大部切除本身也將導(dǎo)致全身各系統(tǒng)出現(xiàn)嚴(yán)重的生理功能紊亂,并促使IFALD的發(fā)生。因此,針對(duì)SBS的治療目標(biāo)主要包括:促進(jìn)剩余腸道功能的康復(fù)與適應(yīng),盡早恢復(fù)經(jīng)口進(jìn)食并擺脫P(yáng)N,預(yù)防和減少IFALD等并發(fā)癥的發(fā)生;目前,SBS的腸康復(fù)治療主要著眼于增強(qiáng)腸道吸收能力、減慢腸道蠕動(dòng)、減少消化液分泌以及手術(shù)延長(zhǎng)腸管等方面。但是,我們對(duì)小腸大部切除后腸道微生態(tài)的變化方向,特別是成人SBS患者腸道菌群的變化特點(diǎn)仍了解甚少。腸道菌群在分解代謝腸內(nèi)容、調(diào)控膽汁酸合成與轉(zhuǎn)運(yùn)、改善腸道免疫功能以及維持腸黏膜屏障完整等方面意義重大。針對(duì)兒童SBS患者的研究表明,腸道菌群的紊亂可以阻礙腸適應(yīng)的進(jìn)程,破壞腸道功能的代償,延長(zhǎng)PN使用時(shí)間,并最終導(dǎo)致不良的臨床預(yù)后。這提示,闡明SBS腸道菌群變化特點(diǎn)及其與剩余腸道功能的關(guān)系可以為腸康復(fù)治療提供新的微生態(tài)靶點(diǎn)。現(xiàn)在認(rèn)為SBS和PN都是導(dǎo)致IFALD的重要原因,且SBS是IFALD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。大量的研究已經(jīng)報(bào)道了 PN參與IFALD發(fā)病的相關(guān)機(jī)制,但是SBS本身如何導(dǎo)致IFALD的發(fā)生仍不是很清楚。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),未使用PN的SBS小型豬模型的腸道和門靜脈中膽汁酸的組成和含量均發(fā)生了顯著變化,表現(xiàn)為初級(jí)膽汁酸增加而次級(jí)膽汁酸減少。研究表明,腸道中的初級(jí)膽汁酸可被特定的菌群代謝和轉(zhuǎn)化為次級(jí)膽汁酸,并進(jìn)一步通過活化末端回腸法尼酯X受體(farnesoidXreceptor,FXR)參與對(duì)肝臟膽汁酸合成的負(fù)反饋調(diào)控;因此我們推測(cè),SBS腸道菌群的變化可能通過改變腸道膽汁酸的組成,使得肝臟膽汁酸的合成和代謝發(fā)生紊亂,進(jìn)而導(dǎo)致IFALD的發(fā)生。本研究首先將利用16S rRNA基因測(cè)序技術(shù)分析不同亞型的成人SBS患者糞便菌群的變化特點(diǎn);然后建立Ⅱ型和Ⅲ型SBS大鼠模型,研究小腸切除術(shù)后不同時(shí)間以及不同腸段的菌群構(gòu)成差異及其與剩余腸道功能的關(guān)系;最后,通過檢測(cè)腸道中膽汁酸代謝相關(guān)細(xì)菌的相對(duì)豐度和膽汁酸的組成,以及肝臟和末端回腸內(nèi)參與膽汁酸合成及調(diào)控的相關(guān)分子的表達(dá)水平,深入探究SBS腸道菌群變化參與IFALD發(fā)病的機(jī)制。本研究將為SBS的腸康復(fù)治療和IFALD的防治提供新的思路。全文共分為三個(gè)部分:第一部分成人短腸綜合征患者糞便菌群變化特點(diǎn)的臨床研究研究目的:比較不同亞型的成人SBS患者糞便菌群的變化特點(diǎn)。研究方法:收集自2015年11月至2016年11月于我院住院治療的Ⅱ型和Ⅲ型SBS患者和來我院體檢的健康志愿者的新鮮糞便及其對(duì)應(yīng)的臨床資料;提取糞便基因組DNA,PCR擴(kuò)增其16SrRNA基因V4-V5區(qū),對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物行高通量測(cè)序和生物信息學(xué)分析。結(jié)果:共納入符合入組標(biāo)準(zhǔn)的Ⅱ型和Ⅲ型SBS患者各5例,并匹配5例健康志愿者作為對(duì)照組。三組研究對(duì)象(Ⅱ型SBS組、Ⅲ型SBS組和對(duì)照組)的性別、年齡和體質(zhì)指數(shù)等無顯著差異;兩組SBS患者的一般臨床特征也無明顯差別。Ⅱ型和Ⅲ型SBS患者的糞便菌群α多樣性均顯著低于對(duì)照組(P0.05);且SBS患者糞便菌群Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)與其剩余小腸長(zhǎng)度成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r分別為0.733(P0.05)和0.891(P0.01)。Ⅱ型SBS患者糞便中變形菌門及其分類下的腸桿菌科的相對(duì)豐度顯著高于其余兩組(P0.01),而厚壁菌門(P0.05)和擬桿菌門(P0.01)的相對(duì)豐度則顯著低于對(duì)照組;Ⅲ型SBS患者糞便中乳酸桿菌科和普氏菌科的相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P0.001)和Ⅱ型SBS患者(P0.01)。來自擬桿菌科、毛螺菌科和瘤胃菌科的有益菌屬的含量在兩組SBS患者糞便中均顯著下降。SBS患者的PN使用時(shí)間與其糞便菌群中腸桿菌科含量成正相關(guān)(r = 0.701,P0.05),而與乳酸桿菌屬含量成負(fù)相關(guān)(r =-0.659,P0.05)。結(jié)論:SBS患者糞便菌群的多樣性顯著下降,其群落組成也與健康人群差別顯著,表現(xiàn)為機(jī)會(huì)致病菌和雜菌增多,而有益菌減少;其中Ⅱ型SBS患者以變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌群,而Ⅲ型SBS患者以乳酸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群。SBS患者PN使用時(shí)間與其糞便菌群的組成有顯著相關(guān)性。第二部分短腸綜合征大鼠腸道菌群變化特點(diǎn)及其與腸道炎癥和腸屏障功能關(guān)系的研究研究目的:比較大鼠在小腸大部切除術(shù)后不同時(shí)間以及不同腸段的腸道菌群變化特點(diǎn),并探究SBS大鼠腸道菌群紊亂與腸道炎癥和腸屏障功能的關(guān)系。研究方法:選用200-250g的Sprague-Dawley(SD)大鼠30只,隨機(jī)分為3組:Ⅱ型SBS大鼠組、Ⅲ型SBS組和假手術(shù)大鼠組。通過切除75%的小腸來建立Ⅱ型(不保留回盲部)和Ⅲ型(保留回盲部)SBS大鼠模型,通過小腸離斷吻合建立假手術(shù)大鼠模型;術(shù)后將各組大鼠再隨機(jī)分為2個(gè)亞組,分別飼養(yǎng)2周或4周。到達(dá)各自研究終點(diǎn)后,收集各組大鼠的降結(jié)腸和回盲部(Ⅱ型SBS大鼠除外)內(nèi)容物標(biāo)本,并對(duì)菌群16S rRNA基因V4-V5區(qū)進(jìn)行高通量測(cè)序;收集近端結(jié)腸標(biāo)本,檢測(cè)結(jié)腸黏膜炎癥因子 IL-8(Interleukin-8)、IL-18(Interleukin-18)和 TNF-α(Tumor necrosis factor-α)的mRNA表達(dá)水平;利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)腸和末端回腸(Ⅱ型SBS大鼠除外)上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白ZO-1(zona occludens protein-1)和Occludin的表達(dá);利用Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗(yàn)菌群多樣性與結(jié)腸黏膜炎癥因子和回結(jié)腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性。結(jié)果:(1)接受同種手術(shù)方式的大鼠模型在術(shù)后2周和4周的腸道菌群變化特點(diǎn)基本一致。Ⅱ型和Ⅲ型SBS大鼠的結(jié)腸和回盲部菌群的α多樣性均顯著低于假手術(shù)大鼠(P0.05),且各組大鼠間菌群β多樣性也具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.001,結(jié)腸菌群;P0.01,回盲部菌群)。1)結(jié)腸菌群比較:相較于假手術(shù)和Ⅲ型SBS大鼠,Ⅱ型SBS大鼠變形菌門的相對(duì)豐度顯著升高(P0.01),而擬桿菌門的相對(duì)豐度則顯著降低(P0.01);術(shù)后第4周,Ⅲ型SBS大鼠厚壁菌門的相對(duì)豐度顯著高于其余兩組大鼠(P0.01),而擬桿菌門則顯著低于假手術(shù)大鼠(p0.01);Ⅱ型和Ⅲ型SBS大鼠結(jié)腸中具有產(chǎn)生短鏈脂肪酸能力的菌屬的含量顯著低于假手術(shù)大鼠,而Ⅱ型SBS大鼠結(jié)腸中腸桿菌科的菌屬含量顯著高于其余兩組。2)回盲部菌群比較:Ⅲ型SBS大鼠厚壁菌門的相對(duì)豐度顯著高于假手術(shù)大鼠(P0.05),而擬桿菌門的相對(duì)豐度顯著低于假手術(shù)大鼠(P0.05);革蘭氏陰性的機(jī)會(huì)致病菌的含量在Ⅲ型SBS大鼠回盲部?jī)?nèi)明顯增加,而益生菌和膽汁酸代謝相關(guān)細(xì)菌的含量則顯著減少。(2)術(shù)后第2周,各組大鼠間結(jié)腸粘膜炎癥因子和回結(jié)腸上皮細(xì)胞間緊密連接蛋白的表達(dá)無顯著差異。術(shù)后第4周,Ⅱ型和Ⅲ型SBS大鼠結(jié)腸黏膜炎癥因子IL-8,IL-18和TNF-α的mRNA表達(dá)水平均顯著高于假手術(shù)大鼠,且與結(jié)腸菌群Shannon指數(shù)成負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)r分別為-0.486,-0.438,-0.458(P0.05)。術(shù)后第4周,Ⅱ型和Ⅲ型SBS大鼠結(jié)腸和末端回腸上皮細(xì)胞間ZO-1和Occludin蛋白的表達(dá)均顯著低于假手術(shù)大鼠,且分別與結(jié)腸或回盲部菌群Shannon指數(shù)成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r分別為0.364和0.554(結(jié)腸,P0.05)以及 0.508 和 0.467(末端回腸,P0.05)。結(jié)論:SBS大鼠剩余腸管的不同部位均存在菌群紊亂;菌群多樣性的下降和群落結(jié)構(gòu)的改變?cè)谛∧c大部切除術(shù)后早期即可出現(xiàn)并持續(xù)存在。腸道菌群多樣性的下降可以加重結(jié)腸炎癥,并導(dǎo)致腸屏障功能障礙。第三部分短腸綜合征大鼠腸道菌群紊亂參與腸衰竭相關(guān)性肝損害發(fā)病的機(jī)制研究研究一 短腸綜合征大鼠腸道菌群紊亂與腸衰竭相關(guān)性肝損害的關(guān)系研究目的:觀察SBS大鼠肝功能及肝臟病理變化;探究SBS大鼠腸道菌群紊亂與IFALD發(fā)病的關(guān)系。研究方法:選取200-250gSD大鼠12只,隨機(jī)分為2組:Ⅲ型SBS大鼠組和假手術(shù)大鼠組。通過切除75%的小腸(保留回盲部)建立Ⅲ型SBS大鼠模型,通過小腸離斷吻合建立假手術(shù)大鼠模型,所有大鼠術(shù)后飼養(yǎng)4周。到達(dá)研究終點(diǎn)后,采集大鼠下腔靜脈血以檢測(cè)血清膽紅素和轉(zhuǎn)氨酶水平;Masson、油紅O和天狼猩紅染色觀察大鼠肝臟病理改變;收集回盲部?jī)?nèi)容物,檢測(cè)初級(jí)和次級(jí)膽汁酸含量,并對(duì)菌群16SrRNA基因V4-V5區(qū)行高通量測(cè)序;留取末端回腸標(biāo)本,檢測(cè) FXR、SHP(small heterodimer partner)和 FGF15(fibroblast growth factor 15)等膽汁酸合成調(diào)控蛋白的表達(dá)水平;留取肝臟標(biāo)本,檢測(cè)膽汁酸合成酶Cyp7a1(cholesterol 7α-hydroxylase)和 Cyp8b1(sterol 12α-hydroxylase)的 mRNA 和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:SBS大鼠的血清直接膽紅素、總膽紅素和谷丙轉(zhuǎn)氨酶水平顯著高于假手術(shù)大鼠(P0.05);且其肝臟內(nèi)匯管區(qū)纖維化、肝細(xì)胞氣球樣變性以及脂滴沉積的程度也明顯重于假手術(shù)大鼠。SBS大鼠回盲部?jī)?nèi)與膽汁酸代謝相關(guān)的細(xì)菌,包括擬桿菌屬(P0.01)、梭菌屬(P0.05)和雙歧桿菌屬(P0.01)的相對(duì)豐度顯著低于假手術(shù)大鼠;并導(dǎo)致其回盲部?jī)?nèi)容物中膽酸(P0.001)和β鼠膽酸(P0.01)等初級(jí)膽汁酸的含量顯著上升,而脫氧膽酸(P0.001)、石膽酸(P0.05)和ω鼠膽酸(P0.01)等次級(jí)膽汁酸的含量顯著下降。SBS大鼠末端回腸內(nèi)負(fù)反饋調(diào)控肝臟膽汁酸合成的FXR-FGF15信號(hào)通路中FXR(P0.05)、SHP(P0.01)和FGF15(P0.001)等關(guān)鍵蛋白的活化顯著減弱;此外,SBS大鼠肝臟內(nèi)膽汁酸合成酶Cyp7a1和Cyp8b1的mRNA(P0.01)和蛋白(P0.05)的表達(dá)水平都顯著高于假手術(shù)大鼠。結(jié)論:SBS大鼠的肝功能和肝臟病理變化表明其出現(xiàn)了明顯的IFALD。腸道中膽汁酸代謝相關(guān)細(xì)菌相對(duì)豐度的減少使得SBS大鼠腸道內(nèi)脫氧膽酸等次級(jí)膽汁酸的含量顯著下降,進(jìn)而減弱了末端回腸FXR-FGF15信號(hào)通路對(duì)肝臟中Cyp7a1等膽汁酸合成酶的負(fù)反饋調(diào)控,從而導(dǎo)致肝臟膽汁酸過度合成、膽汁淤積和IFALD的發(fā)生。研究二 短腸綜合征大鼠腸道次級(jí)膽汁酸含量與腸衰竭相關(guān)性肝損害的關(guān)系研究目的:進(jìn)一步研究SBS大鼠腸道內(nèi)次級(jí)膽汁酸含量的變化在IFALD發(fā)病中的作用,并驗(yàn)證研究一中的結(jié)論。研究方法:選取200-250g SD大鼠18只,切除75%小腸建立Ⅲ型SBS大鼠模型,術(shù)后將SBS大鼠隨機(jī)分為3組,分別為生理鹽水組(Saline)、脫氧膽酸組(DCA)和抗生素組(Antibiotic)。術(shù)后第23-27天,連續(xù)5天,每天分別用生理鹽水(0.5mL/d)、脫氧膽酸(100mg/Kg/d)和混合抗生素(氨芐西林100mg/Kg/d、新霉素 100mg/Kg/d、甲硝唑 100mg/Kg/d、鏈霉素 100mg/Kg/d、萬古霉素 50mg/Kg/d)灌胃各組SBS大鼠。術(shù)后第28天處死大鼠,收集回盲部?jī)?nèi)容物,檢測(cè)DCA含量;留取末端回腸標(biāo)本,檢測(cè)FXR、SHP和FGF15等蛋白的表達(dá);留取肝臟標(biāo)本,油紅O染色觀察肝細(xì)胞內(nèi)脂滴沉積情況,同時(shí)檢測(cè)膽汁酸合成酶Cyp7a1和Cyp8b1的表達(dá)以及肝臟膽汁酸代謝調(diào)控蛋白FXR和SHP的表達(dá)。結(jié)果:DCA組SBS大鼠回盲部?jī)?nèi)容物中DCA的含量顯著高于Saline組(P0.05),并趨向于研究一中假手術(shù)大鼠的水平,而Antibiotic組SBS大鼠的DCA含量則顯著低于Saline組(P0.05)。相較于Saline組,DCA組SBS大鼠末端回腸的FXR、SHP和FGF15的活化水平顯著增強(qiáng)(P0.05),而Antibiotic組SBS大鼠的上述蛋白活化水平則顯著減弱(P0.05);與此同時(shí),膽汁酸合成酶Cyp7a1和Cyp8b1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平在DCA組SBS大鼠肝臟中顯著下降(P0.05),而在Antibiotic組SBS大鼠肝臟中顯著上升(P0.05)。與Saline組相比,脂滴沉積在DCA組SBS大鼠的肝臟內(nèi)明顯減輕,而在Antibiotic組SBS大鼠的肝臟內(nèi)顯著加重。DCA組SBS大鼠肝臟中FXR的表達(dá)水平顯著低于其他兩組(P0.05),但SHP蛋白的表達(dá)在三組SBS大鼠肝臟中無顯著差異。結(jié)論:SBS大鼠腸道內(nèi)DCA等次級(jí)膽汁酸含量的升高可以增強(qiáng)其末端回腸FXR-FGF15信號(hào)通路的活化,并負(fù)反饋抑制肝臟Cyp7a1等膽汁酸合成酶的表達(dá),從而緩解IFALD。這進(jìn)一步證明了 SBS大鼠腸道菌群紊亂是通過減少腸道內(nèi)次級(jí)膽汁酸含量來參與IFALD發(fā)病的。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R574

【參考文獻(xiàn)】

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1 ;Pathogenesis and treatment of parenteral nutrition-associated liver disease[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2012年06期

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本文編號(hào)：1626424