本文選題：非酒精性脂肪性肝炎　切入點(diǎn)：環(huán)氧二十碳三烯酸　出處：《華中科技大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：[研究背景及目的] 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種常見的肝臟疾病,尤其在發(fā)達(dá)國家具有較高的患病率。其定義為無過量飲酒史(或酒精攝入量20g/d),以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性和脂質(zhì)蓄積為特征的臨床病理綜合征。該病的整個病理過程包括單純性脂肪肝、脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化等四個階段。非酒精性脂肪肝患者中約有20%-30%可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎(NASH),其與單純脂肪變性的區(qū)別主要在于肝細(xì)胞氣球樣變和炎癥損傷的存在,并可能最終進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌。[1,2]目前有關(guān)非酒精性脂肪性肝炎形成的確切機(jī)制尚未完全明確,而普遍認(rèn)可的是經(jīng)典的“二次打擊”學(xué)說。所謂的“第一次打擊”是指外周和肝臟的胰島素抵抗所導(dǎo)致的脂質(zhì),尤其是脂肪酸和甘油三酯在肝細(xì)胞中的蓄積,即脂肪變性。而“第二次打擊”則是由氧化應(yīng)激,脂質(zhì)過氧化和大量的炎性因子(如TNF-α, IL-1和IL-6)等多種因素導(dǎo)致的炎癥損傷。[3]而其中TNF-α被認(rèn)為是單純性脂肪肝進(jìn)展為脂肪性肝炎的主要細(xì)胞因子,可以通過1)與肝細(xì)胞膜上受體結(jié)合,活化Casepase-8,進(jìn)而活化Casepase-3,直接導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡；2)抑制線粒體的呼吸功能并增加線粒體活性氧物質(zhì)和過氧化脂質(zhì)的形成,導(dǎo)致肝細(xì)胞膜的破壞和引起炎癥反應(yīng)[4]。3)活化其他炎性細(xì)胞因子如IL-6、IL-8和某些粘附分子,形成放大炎癥效應(yīng),誘發(fā)肝臟炎癥。 研究表明,巨噬細(xì)胞在非酒精性脂肪肝的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。經(jīng)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠NASH模型中,肝臟枯否細(xì)胞大量活化,并且產(chǎn)生多種促炎因子以及ROS,導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。[5]經(jīng)膽堿蛋氨酸缺乏(MCD)飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH模型中,肝臟內(nèi)TNFa及MCP-1的mRNA表達(dá)水平明顯增加,而后者是巨噬細(xì)胞活性的強(qiáng)效介質(zhì)。NASH發(fā)病過程中巨噬細(xì)胞參與肝損傷的機(jī)制,一方面在于無法正確的識別及消除危險因素,另一方面又由于細(xì)胞毒性機(jī)制的過度動員,使得無法阻止炎癥反應(yīng)。另外,巨噬細(xì)胞暴露于游離脂肪酸后,也可通過與相應(yīng)細(xì)胞表面受體及胞內(nèi)信號的相互作用影響炎癥反應(yīng)[6] 環(huán)氧二十碳三烯酸(EET)是花生四烯酸(AA)第三條代謝通路中通過細(xì)胞色素P450表氧化酶催化底物花生四烯酸反應(yīng)生成的代謝產(chǎn)物之一,是具有強(qiáng)大生物學(xué)活性的內(nèi)生性脂質(zhì)環(huán)氧化物。該表氧化酶途徑可產(chǎn)生四種同分異構(gòu)體,即5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET和14,15-EET。但EETs在體內(nèi)半衰期很短,由可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolyse, sEH)迅速降解為活性較低的二羥基-二十碳三烯酸(dihydroxyeicosatrienoic acids, DHETs),因此在體內(nèi)很難研究這些脂環(huán)氧化物。而可溶性環(huán)氧化物水解酶抑制劑(soluble epoxide hydrolyse inhibitor, sEHI)可降低EETs的水解,提高體內(nèi)EETs的水平。 目前已發(fā)現(xiàn)EETs具有多種生理功能,如擴(kuò)張血管,降低血壓,調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和胰島素抵抗等。有多項(xiàng)研究通過應(yīng)用sEH抑制劑,降低體內(nèi)EETs的水解,顯著降低了動物模型體內(nèi)不同器官的炎癥反應(yīng),從而證實(shí)了EET在不同疾病中均具有抗炎作用。Node等人發(fā)現(xiàn)在利用TNF-α,IL-1及LPS刺激內(nèi)皮細(xì)胞時,EETs可通過抑制粘附分子(CAMs)的誘導(dǎo)而發(fā)揮抗炎作用。[7] EETs還可通過抑制單核細(xì)胞合成前列腺素2緩解大鼠模型因注射LPS引起的發(fā)熱。[8]但EETs在非酒精性脂肪性肝炎中的作用及其機(jī)制還沒有被證明。 本研究試圖探討EETs在MCD飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪性肝炎中的保護(hù)性作用及其相關(guān)機(jī)制。具體研究內(nèi)容如下： 建立非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠模型,并用sEH抑制劑TPPU進(jìn)行干預(yù)。1.檢測小鼠肝臟內(nèi)EETs含量的變化；觀察體重、肝重及肝指數(shù)的變化；檢測肝功能(ALT/AST),肝臟及外周血脂含量(TC/TG);觀察小鼠肝組織病理變化及肝細(xì)胞脂肪變性程度；研究EETs在NASH的發(fā)生發(fā)展中對肝臟脂肪變性以及炎性損傷所起到的干預(yù)作用。 2.檢測外周血及肝臟內(nèi)炎性因子(TNF-α、IL-1、IL-6)和趨化因子(MCP-1/CCL2、 IL-8/CXCL8)水平的變化；檢測肝臟內(nèi)PPARα、ICAM-1、VCAM-1等炎性相關(guān)分子mRNA表達(dá)情況,及肝內(nèi)NF-kB的表達(dá)和活化情況,探討EETs在NASH病程中發(fā)揮干預(yù)作用的可能機(jī)制。 二、體外建立肝細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)體系,通過游離脂肪酸刺激及EETs直接干預(yù)后,檢測細(xì)胞上清炎性因子及趨化因子水平的變化,觀察細(xì)胞形態(tài)及胞內(nèi)脂滴大小等變化,探討EETs是否通過抑制巨噬細(xì)胞的促炎作用,在NASH病程中發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。 三、觀察MCD組、MCS組及MCD+TPPU組小鼠肝臟組織中NF-κB總的表達(dá)情況。獲取小鼠原代巨噬細(xì)胞,體外應(yīng)用游離脂肪酸刺激及EETs干預(yù)后,檢測巨噬細(xì)胞NF-κB入核活化的情況,探討EETs通過抑制巨噬細(xì)胞炎性作用在NASH病程中發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)的具體機(jī)制。 [研究方法] 1.通過喂食C57BL/6小鼠蛋氨酸膽堿缺乏(MCD)飲食6周,建立非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠模型,干預(yù)組中則將sEH抑制劑TPPU加入飼水中喂食小鼠。收集1w、2w、4w、5w、6w后模型組、干預(yù)組及對照組小鼠血清及肝組織標(biāo)本。自動生化儀檢測各時間點(diǎn)肝功能(ALT/AST),肝臟及外周血脂含量(TC/TG);ELISA技術(shù)檢測肝臟內(nèi)EETs含量的變化,外周血及肝臟炎性因子(TNF-α、IL-1、IL-6)和趨化因子(MCP-1、IL-8)的表達(dá)水平。應(yīng)用HE染色觀察小鼠肝臟組織病理損傷情況,油紅染色觀察肝細(xì)胞脂肪變性程度。Realtime-PCR方法測定肝臟內(nèi)PPARα、ICAM-1、VCAM-1等炎性相關(guān)分子mRNA表達(dá)情況。免疫組化技術(shù)檢測MCD飲食組、MCS飲食組及MCD+TPPU干預(yù)組小鼠肝臟組織中NF-κB的表達(dá)活化情況。 2.應(yīng)用Transwell小室,體外建立HepG2細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)體系,通過游離脂肪酸(油酸及棕櫚酸)刺激及4種EET同分異構(gòu)體分別干預(yù)后,ELISA檢測刺激組、干預(yù)組及空白對照組細(xì)胞上清炎性因子及趨化因子水平的變化；油紅染色觀察HepG2細(xì)胞形態(tài)及胞內(nèi)脂滴大小變化。 3.應(yīng)用石蠟油腹腔注射,3天后收集小鼠腹腔原代巨噬細(xì)胞,游離脂肪酸刺激下培養(yǎng)巨噬細(xì)胞12小時,干預(yù)組分別加入四種EET同分異構(gòu)體(5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET,14,15-EET)進(jìn)行干預(yù)后,激光免疫共聚焦觀察細(xì)胞內(nèi)NF-κB活化情況；提取巨噬細(xì)胞核蛋白,試劑盒檢測細(xì)胞核內(nèi)NF-κB表達(dá)水平的變化。 [結(jié)果] 1.MCD飲食喂養(yǎng)6周后,小鼠的體重和肝重均明顯下降,肝臟內(nèi)出現(xiàn)大量的脂肪沉積、肝細(xì)胞氣球樣變性及點(diǎn)狀壞死,伴有炎性細(xì)胞的浸潤。同時,肝功能(ALT, AST)明顯升高,血漿內(nèi)甘油三酯和膽固醇水平下降,而肝內(nèi)甘油三酯水平顯著升高。經(jīng)TPPU干預(yù)后,小鼠肝臟內(nèi)EETs的含量顯著增加,肝細(xì)胞損傷和炎性細(xì)胞浸潤的情況得到明顯改善,肝功能及肝內(nèi)甘油三酯水平顯著降低,但對血脂水平和肝細(xì)胞內(nèi)脂肪沉積的無顯著影響。 2.MCD飲食誘導(dǎo)后,肝臟及血清內(nèi)促炎細(xì)胞因子(TNF-α, IL-1, IL-6)以及相關(guān) 3.趨化因子(IL-8, MCP-1)水平均有所升高,尤其是TNF-α, IL-1和MCP-1。而在TPPU干預(yù)組小鼠中,這些指標(biāo)在不同時間點(diǎn)均有所下降。TPPU的干預(yù)還導(dǎo)致了炎癥相關(guān)粘附分子(ICAM-1, VCAM-1) mRNA表達(dá)水平的下調(diào),而與脂類代謝和抗炎密切相關(guān)的過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR-α)的mRNA表達(dá)較NASH組小鼠則有所升高。MCD組較MCS組小鼠肝臟組織中NF-κ B的表達(dá)明顯增強(qiáng),而TPPU干預(yù)組小鼠肝臟組織中NF-κB的表達(dá)較MCD組明顯減弱。 4.為了進(jìn)一步探討EETs是否能夠減少游離脂肪酸(FFA)刺激所誘導(dǎo)的促炎性細(xì)胞因子的釋放及肝細(xì)胞損害,在體外將EETs的四種同分異構(gòu)體5,6-EET,8,9-EET,11,12-EET和14,15-EET-EET分別加入FFA刺激下的3種細(xì)胞體系中：1)HepG2細(xì)胞2)THP-1細(xì)胞3)HepG2和THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)體系。經(jīng)過24小時培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)在HepG2和THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)體系中11,12-EET能顯著降低FFA刺激引起的TNF-a, MCP-1和IL-1β的釋放。5,6-EET和8,9-EET也可一定程度抑制TNF-α和IL-1β的釋放,但效果較弱,而14,15-EET幾乎沒有抑制作用。在游離脂肪酸的刺激下THP-1單獨(dú)培養(yǎng)時,11,12-EET也對TNF-α和IL-1的釋放具有抑制效果,但并沒有在HepG2和THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)體系中的作用顯著。而在HepG2單獨(dú)培養(yǎng)時并未觀察到類似現(xiàn)象。 4.小鼠原代巨噬細(xì)胞在FFA刺激下培養(yǎng),并分別加入四種EET同分異構(gòu)體干預(yù)12小時后,激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn),FFA刺激后NF-κB入核明顯增加,而11,12-EET的干預(yù)可抑制該現(xiàn)象。 [結(jié)論] 1.EETs的水解抑制劑(TPPU)可增加小鼠體內(nèi)EETs的含量,從而改善由MCD飲食誘導(dǎo)的脂肪性肝炎小鼠模型肝臟內(nèi)炎癥損傷、肝功能,降低肝內(nèi)甘油三酯水平,但對肝細(xì)胞脂肪變性沒有明顯的影響。 2. TPPU干預(yù)可顯著降低MCD飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型肝臟及血清內(nèi)促炎細(xì)胞因子以及相關(guān)趨化因子的水平；還導(dǎo)致了炎癥相關(guān)粘附分子表達(dá)水平的下調(diào),而同時上調(diào)了促進(jìn)脂類代謝的分子PPAR-α的表達(dá)。 3.在體外HepG2和THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)體系中11,12-EET能顯著降低FFA刺激誘導(dǎo)下THP-1細(xì)胞分泌的相關(guān)促炎因子,5,6-EET和8,9-EET有類似作用,但效果較弱,而14,15-EET的抑制作用最弱。 4.通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn),NASH小鼠巨噬細(xì)胞中NF-κB的被激活入核,而該條通路可被11,12-EET所抑制,推斷EET極有可能通過抑制巨噬細(xì)胞NF-κB的活化,減少其下游促炎因子的分泌,而在NASH的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R575.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 Osama El-Assal;Won-HoKim;SvetlanaRadaeva;;IL-6-deficient Mice Are Susceptible to Ethanol-induced Hepatic Steatosis:IL-6 Protects against Ethanol-induced Oxidative Stress and Mitochondrial Permeability Transition in the Liver[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年03期

2 黃艷;劉潔;徐焱成;代U，

本文編號：1622986