發(fā)布時(shí)間：2018-03-14 21:22

  本文選題：脂多糖(LPS)　切入點(diǎn)：細(xì)胞凋亡　出處：《內(nèi)蒙古大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腸粘膜屏障是腸道內(nèi)的第一道防線,是可以將腸道細(xì)菌與外界隔開(kāi)的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu),能夠調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)吸收以及粘膜免疫平衡。上皮細(xì)胞的異常凋亡、緊密連接的結(jié)構(gòu)與功能遭到破壞均可以造成腸粘膜屏障損傷。脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種強(qiáng)促炎分子,腸腔內(nèi)細(xì)菌異常繁殖,LPS產(chǎn)生積累過(guò)多,導(dǎo)致粘膜屏障受損,有毒物質(zhì)釋放到血液中,會(huì)引起全身性炎癥反應(yīng)。LPS造成粘膜屏障損傷與上皮細(xì)胞凋亡和緊密連接蛋白功能異常有關(guān),但具體分子機(jī)制尚不明確。本研究選擇人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460為模型,探討LPS對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響及分子機(jī)制,以期為探明LPS致粘膜損傷的機(jī)制提供新的佐證。首先我們利用MTT法、Hoechest 33342染色、流式細(xì)胞術(shù)(AnnexinV-PI雙染法)、熒光分光光度計(jì)法以及Western-blot等方法研究LPS是否誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460增殖或凋亡以及對(duì)緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)LPS能夠顯著抑制NCM460細(xì)胞增殖且具有濃度依賴性;(2)LPS能夠誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞發(fā)生凋亡,有濃度和時(shí)間依賴特點(diǎn),細(xì)胞凋亡水平隨LPS濃度提高或處理時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì);(3)LPS能夠抑制緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達(dá),抑制作用隨LPS濃度提高明顯加強(qiáng)。這些結(jié)果表明LPS可以抑制人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460增殖,誘導(dǎo)其凋亡,并且顯著抑制緊密連接蛋白的表達(dá),預(yù)示著LPS造成粘膜屏障損傷可能是通過(guò)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡并抑制緊密連接蛋白的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。其次,本研究探討LPS誘導(dǎo)結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460發(fā)生凋亡的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)LPS刺激NCM460細(xì)胞分泌TNF-α,與對(duì)照組相比,TNF-α基因轉(zhuǎn)錄水平明顯升高(p0.01),細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α的含量也明顯升高(p0.05);(2)LPS刺激可以導(dǎo)致細(xì)胞高表達(dá)死亡受體TNFR1、死亡接頭蛋白FADD;(3)LPS刺激NCM460細(xì)胞后Caspase 8的活性明顯上升(p0.01),而Caspase 9的活性與對(duì)照相比卻沒(méi)有顯著性變化(p0.05);(4)Caspase 8抑制劑Z-LETD-FMK顯著抑制LPS誘導(dǎo)的NCM460細(xì)胞凋亡(p0.05)以及TNFR1和FADD的高表達(dá);(4)LPS刺激NCM460細(xì)胞后,MyD88的表達(dá)水平升高,而TIRAP的表達(dá)卻不受LPS刺激的影響;(5)LPS處理細(xì)胞,膜受體TLR4封閉組與未封閉組相比,TNFR1、MyD88、FADD的表達(dá)水平均有明顯下降,Caspase 3和Caspase8的活性也明顯降低(p0.05);(6)TNF-α處理NCM460細(xì)胞,通過(guò)膜受體TNFR1促進(jìn)FADD的表達(dá)。從以上結(jié)果我們得出下列結(jié)論:(1)LPS通過(guò)死亡受體途徑誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞發(fā)生凋亡;(2)NCM460細(xì)胞通過(guò)膜受體TLR4識(shí)別LPS,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MyD88依賴型的,構(gòu)成LPS/TLR4/MyD88信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;(3)LPS通過(guò)MyD88依賴通路誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞分泌TNF-α。TNF-α通過(guò)其受體TNFR1(死亡受體)調(diào)節(jié)FADD表達(dá),激活死亡受體途徑,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。最后,本研究探討了 mTORC1信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子STAT1、NF-κB對(duì)LPS誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)LPS刺激NCM460細(xì)胞能夠激活mTORC1與轉(zhuǎn)錄因子STAT1以及NF-κB,且STAT1與NF-κB p65的磷酸化受mTORC1調(diào)節(jié);(2)Rapamycin減弱LPS誘導(dǎo)的MyD88、FADD蛋白合成以及FLIP基因轉(zhuǎn)錄;(3)Rapamycin抑制LPS誘導(dǎo)的NCM460細(xì)胞凋亡、TNF-α的分泌以及Caspase 3和Caspase 8的活性。從以上結(jié)果我們推測(cè)mTORC1可能通過(guò)激活與凋亡相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子STAT1以及NF-κB來(lái)調(diào)節(jié)LPS誘導(dǎo)的NCM460細(xì)胞凋亡,更具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。綜上所述,LPS可以誘導(dǎo)人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460凋亡,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為MyD88依賴型。細(xì)胞通過(guò)膜表面受體TLR4識(shí)別LPS,繼而通過(guò)MyD88信號(hào)接頭蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào),構(gòu)成LPS/TLR4/MyD88信號(hào)通路,介導(dǎo)LPS信號(hào)調(diào)控細(xì)胞分泌炎癥因子TNF-α;TNF-α可以通過(guò)死亡受體TNFR1促進(jìn)FADD蛋白高表達(dá),從而激活Caspase 8/Caspase 3相關(guān)凋亡通路,引發(fā)細(xì)胞凋亡;mTORC1信號(hào)通路對(duì)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB以及STAT1活性具有調(diào)節(jié)作用,進(jìn)而調(diào)控凋亡相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá),實(shí)現(xiàn)對(duì)LPS誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。本研究所得數(shù)據(jù)為闡明LPS誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡以及腸粘膜損傷的分子機(jī)制提供了新的證據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R574

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1612999