發(fā)布時間：2018-03-10 15:21

  本文選題：丙型肝炎病毒　切入點(diǎn)：人胚胎干細(xì)胞　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：由丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）所致的急、慢性感染，并逐漸發(fā)展為肝硬化、肝纖維化，甚至肝細(xì)胞肝癌，是目前公認(rèn)的危害全球人類健康的重大傳染性疾病。從1989年HCV首次發(fā)現(xiàn)和鑒定以來，HCV的發(fā)病機(jī)制、生命周期、抗病毒藥物以及疫苗研究方面進(jìn)展非常緩慢，這是因為HCV感染具有嚴(yán)格的種屬特異性，其自然感染宿主僅限于人和黑猩猩。缺乏HCV自然感染的體外細(xì)胞模型以及體內(nèi)動物模型成為制約HCV研究領(lǐng)域發(fā)展的重要原因。 人的肝細(xì)胞是HCV感染的宿主細(xì)胞，但人肝細(xì)胞來源有限，且為終末分化細(xì)胞；而目前大部分HCV體外研究的細(xì)胞模型均為肝腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞，無法模擬正常人肝細(xì)胞的感染及深入進(jìn)行HCV感染機(jī)制的研究。 將人肝細(xì)胞植入小鼠體內(nèi)構(gòu)建人源化肝臟嵌合鼠是HCV研究的理想動物模型。感染性HCV和肝損傷免疫缺陷小鼠是構(gòu)建該疾病模型的前提條件，而選擇對HCV易感的、具有高度增殖、分化和植入能力的靶細(xì)胞則是關(guān)鍵。 常見用于構(gòu)建人源化肝臟模型的小鼠包括：NOD/SCID鼠、uPA-SCID鼠、ALB-uPA-SCID鼠、FRG小鼠和AFC8-hu HSC/Hep小鼠等。用于移植的細(xì)胞多數(shù)為尸體肝臟分離獲得的原代肝細(xì)胞，來源非常有限，體外無法長期培養(yǎng)，且原代肝細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，移植回小鼠肝內(nèi)后，整合及再生的能力有限，因此原代肝細(xì)胞不是構(gòu)建人源化肝臟小鼠的理想種子細(xì)胞來源。 人的胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells, hESCs）由于具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性，能在體內(nèi)、外被誘導(dǎo)分化為機(jī)體幾乎所有的細(xì)胞類型，因此成為構(gòu)建體外HCV感染細(xì)胞模型及人源化肝臟嵌合小鼠模型的理想種子細(xì)胞。自2001年開始，多個研究團(tuán)隊利用小鼠ESCs、hESCs甚至人的誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞（iPSCs），采用不同的誘導(dǎo)分化方案，將其誘導(dǎo)分化成肝細(xì)胞樣細(xì)胞。這些誘導(dǎo)分化來的細(xì)胞具有肝細(xì)胞相似的形態(tài)及肝細(xì)胞的功能，但功能仍不完善。 隨著HCV JFH-1病毒株的分離及其體外Huh7細(xì)胞培養(yǎng)模型的建立，對HCV生命周期的研究逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)，宿主細(xì)胞表面的特異性受體及某些蛋白分子決定了宿主細(xì)胞對HCV的易感性。與HCV入侵密切相關(guān)的受體及蛋白分子包括低密度脂蛋白受體（LDLR）、CD81、清道夫受體BI（SR-BI）、claudin-1（CLDN-1）及occludin（OCLN）等，其中細(xì)胞間緊密連接（tight-junction，TJ）中的OCLN不僅是HCV入侵的必要條件，而且通過介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞間的相互作用決定了細(xì)胞的分化命運(yùn)。 因此，我們期望以人胚胎干細(xì)胞為種子細(xì)胞，通過小分子、細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）組合在體外建立并優(yōu)化分步誘導(dǎo)方案，以提高干細(xì)胞的增殖分化效率，獲得功能完善的肝細(xì)胞樣細(xì)胞；在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用高感染性的HCVcc對誘導(dǎo)分化不同階段的細(xì)胞進(jìn)行感染展開HCV體外感染規(guī)律的研究，尋找具有較高HCV易感性的肝系細(xì)胞分化階段；應(yīng)用小分子或細(xì)胞因子組合，提高肝系細(xì)胞對HCV的易感性；將具有高易感性的肝系細(xì)胞感染后，再移植回FR小鼠體內(nèi)，構(gòu)建HCV易感的人源化肝臟小鼠，獲得能夠模擬人體自然感染過程的體外HCV感染細(xì)胞模型及整合效率更高、HCV易感的人源化肝臟嵌合鼠模型，為研究HCV發(fā)病機(jī)制、生命周期及抗病毒藥物靶點(diǎn)篩選奠定基礎(chǔ)和提供技術(shù)平臺，也為突破疾病動物模型建立的傳統(tǒng)模式探索新思路。具體研究內(nèi)容及結(jié)果如下： 一、hESCs肝向誘導(dǎo)分化體系建立及HCV感染規(guī)律研究 根據(jù)體內(nèi)肝臟發(fā)育分化的譜系特點(diǎn)，應(yīng)用stepwise策略，分別在誘導(dǎo)分化的不同階段加入不同的細(xì)胞因子和小分子化合物組合，篩選和建立了將hESCs向成熟、有功能的肝細(xì)胞誘導(dǎo)分化的方案；經(jīng)過上述優(yōu)化的stepwise誘導(dǎo)分化體系的作用，獲得的肝細(xì)胞樣細(xì)胞能夠分泌白蛋白、尿素；PAS染色呈陽性；具有ICG的吸收和排泌功能；細(xì)胞的同質(zhì)性較好（細(xì)胞中人ALB的表達(dá)量可達(dá)91.4%）。stepwise誘導(dǎo)分化策略的建立及功能性肝細(xì)胞的獲得為后續(xù)體外HCV易感性研究奠定了基礎(chǔ)。 通過分步誘導(dǎo)策略，使細(xì)胞處于發(fā)育分化的特定階段，再以HCVcc感染不同階段的細(xì)胞，探索HCV體外感染規(guī)律的變化。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)分化早期的細(xì)胞（ES、DE）不能被HCVcc感染，當(dāng)誘導(dǎo)分化進(jìn)入HS階段可被HCVcc感染，HB階段的細(xì)胞具有較高的HCV RNA拷貝數(shù)，成熟肝細(xì)胞樣細(xì)胞對HCV的易感性下降；盡管與HCV入侵相關(guān)的OCLN蛋白，在ES向肝細(xì)胞分化過程中表達(dá)量沒有顯著改變，但分布位置發(fā)生了改變，細(xì)胞極性是影響HCV入侵以及影響宿主細(xì)胞對HCV易感性的主要原因。 二、VEGF調(diào)節(jié)分化細(xì)胞極性從而改變其對HCV易感性的研究 本研究將外源性VEGF引入誘導(dǎo)分化體系中，一方面觀察其對誘導(dǎo)分化細(xì)胞向肝系細(xì)胞分化的影響，另一方面驗證其對細(xì)胞極性形成的影響，進(jìn)而觀察VEGF能否促進(jìn)誘導(dǎo)分化細(xì)胞對HCV的易感性。qRT-PCR和細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，加入VEGF后，，有助于維持誘導(dǎo)分化細(xì)胞的干性，也有助于提高HCV的易感性。VEGF是通過降低OCLN的磷酸化水平，進(jìn)而促使OCLN由膜頂面向基底膜轉(zhuǎn)移，使細(xì)胞處于去極化狀態(tài)，最終影響細(xì)胞對HCV的易感性。 三、基于hESCs的人源化肝臟小鼠模型構(gòu)建及其HCV易感性研究 為獲得HCV易感的人源化肝臟小鼠模型，本研究采取了新的構(gòu)建策略：首先選取體外具有較高HCV易感性的HB階段細(xì)胞，將其在體外先進(jìn)行感染；然后再將感染的細(xì)胞肝內(nèi)原位注射移植回小鼠體內(nèi)，通過規(guī)律性撤除NTBC使小鼠肝細(xì)胞發(fā)生不可逆的損傷，從而使移植回的人肝祖細(xì)胞能夠有效整合到Fah/Rag2/小鼠肝內(nèi)。實驗結(jié)果證實，經(jīng)過這種策略構(gòu)建的人源化肝臟小鼠，能夠成功挽救NTBC撤藥小鼠的生命，生存率可達(dá)75%；肝組織免疫組織化學(xué)染色證明，植入的細(xì)胞是人源的細(xì)胞（FAH、抗人肝細(xì)胞抗體、ALB等均為陽性），同時這些細(xì)胞也表達(dá)HCV的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A和核心蛋白Core；但在構(gòu)建的人源化肝臟小鼠模型中未檢測到病毒血癥的發(fā)生。 四、IFN-β-siRNA干擾提高HCV感染性的體內(nèi)/外研究 HCV感染肝細(xì)胞后，主要引起肝細(xì)胞自身免疫反應(yīng)，通過產(chǎn)生I型干擾素（IFN-α/β）達(dá)到清除病毒的目的。因此，我們利用IFN-β的siRNA，探索體內(nèi)、外干擾IFN-β后，是否可減少肝細(xì)胞對HCV的清除，從而使攜帶病毒的肝細(xì)胞整合入FR小鼠肝臟后產(chǎn)生病毒血癥。研究表明，經(jīng)過siRNA干擾作用，持續(xù)感染的細(xì)胞中HCV RNA拷貝數(shù)能夠維持在105數(shù)量級長達(dá)8天，說明針對IFN-β的siRNA干擾，具有減少自身免疫對HCV清除的作用；在體內(nèi)干擾實驗中，我們?nèi)匀晃从^察到病毒血癥的發(fā)生，但針對IFN-β的siRNA作用可減少肝細(xì)胞對病毒的清除。 綜上，本研究建立了高效的誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向肝細(xì)胞分化成熟的培養(yǎng)體系，誘導(dǎo)分化細(xì)胞能夠功能性整合入FR小鼠肝內(nèi)，成功構(gòu)建了人源化肝臟小鼠模型；揭示了HCV感染肝系細(xì)胞的譜系特異性規(guī)律，即發(fā)育分化早期的肝干細(xì)胞就對HCV易感，而在肝系細(xì)胞中，肝祖細(xì)胞具有更高的HCV易感性；初步闡明細(xì)胞間緊密連接及細(xì)胞極性影響HCV易感性的機(jī)制；提出新的構(gòu)建HCV易感的人源化肝臟小鼠模型新策略，基于此策略構(gòu)建的HCV感染的人源化肝臟小鼠模型，為開展HCV生命周期研究、致病機(jī)理研究及抗HCV復(fù)制藥物篩選和評價提供了新的技術(shù)平臺。
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【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R-332;R512.63

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 EdwinC.Ouyang;CatherineH.Wu;CherieWalton;KittichaiPromrat;GeorgeY.Wu;;Transplantation of human hepatocytes into tolerized genetically immunocompetent rats[J];World Journal of Gastroenterology;2001年03期

2 ;Hepatic differentiation capability of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells[J];World Journal of Gastroenterology;2004年19期

本文編號：1593918