發(fā)布時(shí)間：2018-02-14 22:12

  本文關(guān)鍵詞： 非酒精性脂肪肝 利拉魯肽 JNK通路 脂聯(lián)素　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景 非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是以肝細(xì)胞脂肪變性和脂肪蓄積為主要特征,同時(shí)無過量飲酒史的一種臨床病理綜合征。NAFLD是一種常見的慢性肝病,在世界范圍內(nèi)廣泛分布,目前認(rèn)為NAFLD是與胰島素抵抗(IR)密切相關(guān),包含單純性脂肪肝、脂肪性肝炎和肝硬化。各種原因使肝內(nèi)脂肪堆積超過5%或肝活檢發(fā)現(xiàn)單位肝細(xì)胞中大約有1/3以上有脂肪滴者稱為脂肪肝,其中NAFLD占80%。 近年來,隨著人們生活水平的改善,大量脂肪的攝入,肥胖、糖尿病的發(fā)病率增加,NAFLD的發(fā)病率明顯增加,并有年輕化趨勢,已成為病毒性肝炎之后第二大慢性肝病。非酒精性脂肪肝的發(fā)病率較前升高,單純性脂肪肝有10%-25%的患者發(fā)展為NASH,10%-15%的非酒精性脂肪肝炎(NASH)患者發(fā)展為肝硬化甚至肝癌。NAFLD的發(fā)病機(jī)制目前仍然未完全闡明。目前大家一致認(rèn)同NAFLD與胰島素抵抗、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、異常的炎癥因子和線粒體功能異常等因素形成的“二次打擊”學(xué)說密切相關(guān)。第一次打擊是脂質(zhì)代謝紊亂,導(dǎo)致單純性脂肪肝,而以胰島素抵抗、脂質(zhì)過氧化、炎癥反應(yīng)及氧應(yīng)激為核心的二次打擊最終導(dǎo)致脂肪變的肝臟產(chǎn)生炎癥、壞死甚至纖維化。 JNK1在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用,JNK1信號(hào)通路的激活是IR和炎性反應(yīng)的主要影響因素。JNK1因敲除可以減輕炎癥及高脂飲食誘導(dǎo)的IR和肝脂肪變,進(jìn)而防止肝臟炎性反應(yīng)和肝纖維化。目前認(rèn)為TNF-α、FFAs、氧化應(yīng)激均是JNK信號(hào)通路的特異性激動(dòng)劑,同時(shí)它們都能干擾INS信號(hào)傳導(dǎo)從而導(dǎo)致IR。脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種特異性蛋白,具有增加胰島素敏感性、抗纖維化及抗炎等作用,在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。大量的動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脂聯(lián)素與肥胖、IR、冠心病及NAFLD密切相關(guān)。 目前對NAFLD治療局限于增加胰島素敏感性、改變生活方式、減肥或外科手術(shù)治療。轉(zhuǎn)變生活方式、減肥或外科手術(shù)對大多數(shù)人來說很難實(shí)現(xiàn),因此有效治療NAFLD的藥物是迫切需要的。 利拉魯肽是GLP-1類似物,與天然GLP-1有97%的同源性,通過增加胰島素分泌、改善胰島細(xì)胞功能、減少食物入量及體重等多種機(jī)制發(fā)揮降糖作用。目前動(dòng)物和人體的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GLP-1改善胰島素抵抗及肝脂質(zhì)沉積,對NAFLD有一定的作用。而利拉魯肽是否能改善氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化及炎癥反應(yīng)尚未明確,利拉魯肽的上述作用是否與脂聯(lián)素含量及JNK信號(hào)通路有關(guān)及對NAFLD的影響目前尚無報(bào)道。本研究通過高脂飲食建立NAFLD大鼠模型,探討利拉魯肽對NAFLD大鼠的影響及機(jī)制。 目的 本研究利用高脂飲食建立NAFLD大鼠模型,通過觀察利拉魯肽藥物干預(yù)后大鼠肝組織ADP、TG、TC、FFAs、MAD、SOD、TNF-α含量及血清ADP、TG、TC, TGF-β1、FBG水平的變化,同時(shí)觀察大鼠肝組織JNK1、p-JNK1水平及p-JNK1/JNK1,探討GLP-1類似物利拉魯肽對NAFLD大鼠血清和肝組織脂聯(lián)素含量及肝臟甘油三酯和游離脂肪酸含量,及對胰島素抵抗、肝臟氧化應(yīng)激及上述炎癥因子的影響,進(jìn)而探討利拉魯肽防止非酒精性脂肪肝病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制,為開發(fā)有效的藥物治療提供依據(jù)。 方法 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立雄性SD大鼠30只,購自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,普通飲食喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常組(ND組)10只,繼續(xù)喂養(yǎng)普通飲食。高脂模型組20只,予高脂高膽固醇飼料喂養(yǎng)至第12周末,隨機(jī)抽取老鼠正常組1只和高脂模型組1只處死,取部分肝臟和血液,檢測高脂模型組血清甘油三酯、膽固醇、轉(zhuǎn)氨酶及肝指數(shù)等顯著增高,進(jìn)行肝組織切片HE染色肝細(xì)胞明顯脂肪變性確認(rèn)制備模型成功,造模成功后,實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)措施如下：ND組,9只,予普通飲食+等劑量的生理鹽水腹腔注射,時(shí)間13-16w; HFHC組,9只,予高脂高膽固醇飲食+等劑量的生理鹽水腹腔注射,時(shí)間13-16w; GLP-1組,10只,予高脂飲食+利拉魯肽0.6mg/(kg·d)腹腔注射,時(shí)間13—16w。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自由飲水和進(jìn)食,分籠6籠飼養(yǎng),每籠5只,溫度25℃左右、明暗各12h的動(dòng)物室內(nèi)。16周末,禁食12小時(shí)后予水合氯醛溶液腹腔麻醉處死所有大鼠,下腔靜脈采血分離血清,取部分肝組織于液氮速凍后低溫保存,另取部分肝組織行病理檢查。 2、肝指數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)稱體重和肝濕重,肝濕重/體重x100%,即為肝指數(shù)。 3、血清中指標(biāo)的測定將下腔靜脈留取的血液3000r/min離心10分鐘,取上層血清,通過全自動(dòng)生化分析儀測定ALT、FBG、TG和TC,血清胰島素(FINS)、脂聯(lián)素(ADP)和轉(zhuǎn)換生長因子β1(TGF-β1)采用酶聯(lián)免疫吸附法測定,計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=[空腹血糖(FBG)×FINS]/22.5。 4、肝勻漿指標(biāo)的測定精確稱取相同部位的肝組織200mg,置于1.8ml勻漿介質(zhì),冰浴條件下2000r/min勻漿3-5分鐘,制備成10%的肝組織勻漿。肝組織TNF-α和ADP通過酶聯(lián)免疫吸附法測定,肝組織TG和TC使用GPO-PAP法檢測,分光光度計(jì)測定肝勻漿超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MAD)及游離脂肪酸(FFAs)。 5、western blot測定肝組織JNK1及p-JNKl的表達(dá)取肝臟組織約100mg,液氮研磨后加入1ml蛋白裂解液,冰上靜置30min后,4℃,20000xg,離心30min,取上清,BCA法蛋白定量。蛋白變性后,行SDS-PAGE電泳,濕轉(zhuǎn)法將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,脫脂奶粉室溫封閉2h,分別加入JNK1抗體(1：1000)及P-JNK1抗體(1：200),于4℃搖床上孵育過夜,TBST洗膜后,加入二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠IgG,1：5000),于4℃搖床上孵育2h,洗滌后用發(fā)光發(fā)顯影曝光,用FluorChem8900軟件進(jìn)行分析蛋白條帶。 6、病理學(xué)檢查部分肝組織以10%的中性福爾馬林溶液固定,制備冰凍切片及石蠟切片,采用油紅0染色及HE染色。 7、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析,其中計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；其中多組間比較,用單因素方差分析(one-way ANOVA),方差齊者(P0.05)用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間的兩兩比較,方差不齊者(P0.05)采用Welch校正法,組間兩兩比較用Dunnett's T3法,等級資料采用Kruskal-Wallis H非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行分析,其中均以P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、大鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)的變化 與ND組相比,HFHC組大鼠肝指數(shù)和體質(zhì)量明顯增高(P0.05)；與HFD組相比,GLP-1組大鼠肝指數(shù)和體質(zhì)量均顯著下降(P0.05):GLP-1組與正常飼養(yǎng)組相比,大鼠體質(zhì)量無顯著差異(PO.05),肝指數(shù)增高(P0.05)。 2、大鼠糖代謝及胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)的變化 模型組與正常飼養(yǎng)組相比,大鼠FBG和HOMA-IR明顯升高(P0.05),差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)美國糖尿病協(xié)會(huì)糖尿病指南的標(biāo)準(zhǔn)：HOMA-IR2.69為有胰島素抵抗的標(biāo)準(zhǔn),與正常組和GLP-1組相比,模型組老鼠出現(xiàn)糖耐量減低(IGT)和胰島素抵抗(IR)等明顯的糖代謝異常,利拉魯肽治療4周后,FBG和HOMA-IR明顯恢復(fù)至正常。 3、大鼠血清TG、TC、ALT和TGF-β1的變化 與正常組相比,模型組血清TG.TC.ALT和TGF-β1水平明顯升高(1.98±0.40vs.1.26±0.24mrnol/L,0.80±0.14vs.0.41±0.13mmol/L,59.44±12.43vs.46.56±6.39U/L,0.89±0.86vs.0.74±0.90ug/mL,P0.05).與模型組相比,利拉魯肽治療后能明顯降低血清TG、TC、ALT和TGF-β1的水平(1.36±0.20vs.1.98±0.40mmol/L,0.47±0.10vs.0.80±0.14mmol/L,48.90±10.57vs.59.44±12.43U/L,0.75±0.9lvs.0.89±0.86ug/mL P0.05). 4、大鼠肝臟氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化及炎癥反應(yīng)的變化 發(fā)生NAFLD時(shí),肝細(xì)胞中過剩的FFAs發(fā)生脂質(zhì)過氧化,產(chǎn)生大量的ROS最終導(dǎo)致氧化應(yīng)激。與正常組相比,模型組大鼠肝勻漿MAD,FFAs,TNF-α水平明顯升高,同時(shí)SOD水平明顯降低(9.12±2.60vs.6.50±1.79nmol/mg,153.1±32.9vs.105.2±26.9umol/g,3.0l±0.54vs.1.83±0.64ug/ml,172.3±6.3vs.188.7±13.0U/mg,P0.05).我們觀察到經(jīng)過利拉魯肽治療后,大鼠肝勻漿MAD,FFAs,TNF-α水平明顯降低,同時(shí)SOD水平明顯升高(6.95±2.99vs.9.12±2.60nmol/mg,118.7±36.1vs.153.1±32.9umol/g,2.23±0.30vs.3.01±0.54ug/ml,193.4±7.1vs.172.3±6.3U/mg,P0.05). 5、大鼠肝臟脂質(zhì)沉積及病理指標(biāo)的變化 正常組和GLP-1組未見脂肪沉積或炎癥浸潤,模型組出現(xiàn)明顯的脂肪變及氣球樣變,油紅0染色可見明顯的肝脂質(zhì)沉積,利拉魯肽干預(yù)后可見肝內(nèi)脂肪明顯減少。 6、大鼠血清及肝組織脂聯(lián)素的變化 脂聯(lián)素可以改善糖脂代謝,在非酒精性脂肪肝的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。與正常組相比,模型組血清及肝組織脂聯(lián)素明顯降低(68.1±2.5vs.74.9±6.4ug/L,124.6±12.9vs.150.1±18.9ug/L,P0.05).經(jīng)利拉魯肽治療后,大鼠血清及肝組織脂聯(lián)素明顯升高(74.8±7.1vs.68.1±2.5ug/L,148.4±19.2vs.124.6±12.9ug/L,P0.05). 7、大鼠肝組織JNK1、p-JNK1表達(dá)水平 與正常組相比,模型組大鼠肝組織JNK1、p-JNK1表達(dá)水平及p-JNK1/JNK1明顯升高(PO.05)。經(jīng)利拉魯肽治療4周后,JNK1、p-JNK1表達(dá)水平及p-JNK1/JNK1明顯降低恢復(fù)至正常(PO.05)。 結(jié)論 1、本研究使用高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠12周,成功的構(gòu)建了SD大鼠NAFLD模型,該模型伴有IR、高脂血癥、血清轉(zhuǎn)氨酶升高等代謝綜合癥特征,符合人類脂肪肝的特征及演變過程。 2、利拉魯肽能明顯改善NAFLD大鼠肝功能、糖脂代謝紊亂及胰島素抵抗。 3、利拉魯肽能明顯改善NAFLD大鼠肝氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化及炎癥反應(yīng)。 4、利拉魯肽能明顯增加NAFLD大鼠血清及肝組織脂聯(lián)素含量、降低肝組織JNK1、p-JNKl表達(dá),可能是其降低NAFLD大鼠肝組織炎癥指標(biāo)水平、改善胰島素抵抗和肝病理指標(biāo)的重要機(jī)制之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R575.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 李青艷;王績凱;馮哲偉;李迎春;;非酒精性脂肪肝患者脂質(zhì)過氧化與肝功能的相關(guān)性研究[J];重慶醫(yī)學(xué);2012年16期

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本文編號(hào)：1511739