本文關(guān)鍵詞： 結(jié)腸炎 炎癥 上皮細(xì)胞 TNFAJP8L(Tipe) 結(jié)腸炎 炎癥 固有免疫 TNFAIP8L2(TIPE2)　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：哺乳動(dòng)物腸道上皮層形成天然屏障將機(jī)體和多種腸腔內(nèi)容物如食物,腸道微生物,消化產(chǎn)物和藥物等隔離開來(lái)。腸道上皮細(xì)胞三至五天更新一次以適應(yīng)腸腔內(nèi)容物的持續(xù)變化,其完整性的維持依賴于對(duì)增殖,遷移,分化和凋亡信號(hào)的嚴(yán)格調(diào)控。協(xié)調(diào)活化參與這些過(guò)程的信號(hào)分子對(duì)維持腸道穩(wěn)態(tài),阻止炎癥性結(jié)腸炎的發(fā)生至關(guān)重要。炎癥性腸道疾病(inflammatory bowel diseases, IBD)如潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn's氏病,與腸道反復(fù)發(fā)作不可控制的炎癥密切相關(guān),導(dǎo)致腸道組織廣泛損傷,異常增生,最嚴(yán)重的并發(fā)癥是結(jié)直腸癌,多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)二者之間的清晰關(guān)系。盡管已經(jīng)闡明很多信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)維持正常腸道上皮細(xì)胞,然而在調(diào)節(jié)針對(duì)外界應(yīng)急或者損傷情況下腸道組織穩(wěn)態(tài)恢復(fù)的分子事件方面仍然知之甚少。 腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的蛋白8(Tumor necrosis factor-a induced protein-8, TNFAIP8或Tipe)是第一個(gè)被鑒定出來(lái)的Tipe家族成員。多項(xiàng)研究表明Tipe可能通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮促癌作用。在腫瘤細(xì)胞過(guò)表達(dá)Tipe與腫瘤的增生、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。與此相反,Tipe可能促進(jìn)糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的正常胸腺細(xì)胞的凋亡。也有報(bào)道顯示Tipe與活化形式的Gαi3相互作用調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和轉(zhuǎn)化。Tipe基因過(guò)表達(dá)或者基因多態(tài)性與金黃色葡萄球菌感染,腫瘤的發(fā)生和牛皮癬的發(fā)生有關(guān)。但是對(duì)于Tipe在生理?xiàng)l件下和疾病狀況下的精確作用知之甚少。考慮到Tipe在調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡和增殖方面的作用,在本項(xiàng)研究中,我們利用葡聚糖硫酸酯鈉鹽(dextran sodium sulfate, DSS)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型研究Tipe在調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞損傷和粘膜炎癥中的作用。結(jié)果顯示Tipe在急性結(jié)腸炎疾病過(guò)程中對(duì)于維持腸道穩(wěn)態(tài)發(fā)揮至關(guān)重要的作用。 研究目的 1.構(gòu)建Tipe基因缺陷小鼠并尋找Tipe基因缺陷小鼠的表型。 2.探討Tipe在DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型中的作用及其機(jī)制。 研究方法 1.構(gòu)建Tipe基因缺陷小鼠 從德克薩斯基因組醫(yī)學(xué)研究所獲得Tipe基因缺陷的C57BL/6(B6)胚胎干細(xì)胞。將Tipe基因缺陷的誘騙載體插入到該基因唯一的內(nèi)含子內(nèi)。將胚胎干細(xì)胞注入小鼠囊胚中產(chǎn)生嵌合小鼠。在產(chǎn)生的六只嵌合小鼠中,其中五只是雄性小鼠,一只是雌性小鼠,從其中一只雄性小鼠獲得該基因缺陷的穩(wěn)定遺傳。雜合子小鼠交配繁殖出純合子Tipe-/-小鼠,一旦鑒定出純合子小鼠,用特異性引物進(jìn)一步驗(yàn)證確定無(wú)Tipe mRNA的表達(dá)。 2.Tipe-/-小鼠表型分析 六到八周小鼠處死后獲取免疫器官并稱重,勻漿研磨獲取單細(xì)胞懸液,計(jì)算每個(gè)器官得到的細(xì)胞總數(shù),并用流式抗體CD4, CD8, B220, Ly-6G, CD11b, CD11c, NK1.1, CD25, CD44, Foxp3, CD62L, and CD69檢測(cè)所占百分比。 3.結(jié)腸炎模型的誘導(dǎo) 以3%或者4%DSS濃度(w/v)的DSS喂養(yǎng)八至十二周雄性小鼠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎動(dòng)物模型。在生存實(shí)驗(yàn)研究中,小鼠以含4%DSS的飲用水喂養(yǎng)五天,接著以正常飲用水喂養(yǎng)九天。在其它實(shí)驗(yàn)研究中,小鼠以含3%DSS的飲用水喂養(yǎng)五天,接著以正常飲用水喂養(yǎng)直至第七天實(shí)驗(yàn)結(jié)束。每天觀察小鼠的疾病變化直至第七天處死小鼠,如果病情嚴(yán)重未至實(shí)驗(yàn)結(jié)束第七天,則立即處死小鼠。 4.結(jié)腸炎模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 在每一次實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天觀察小鼠并以臨床疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activityindex,DAI)評(píng)價(jià)病情,DAI是基于體重丟失,糞便完整性和直腸出血情況三項(xiàng)指標(biāo)(0-12分)的評(píng)價(jià)體系。具體計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)如下：體重丟失(沒(méi)有變化=0；,5%=1；6-10%=2；11-20%=3；.20%=4),糞便(正常=0；軟,形成良好=1；軟且不能形成糞塊=2；腹瀉=4),血便(無(wú)血=0；直腸可見(jiàn)血斑=1；直腸多處血斑=2；直腸血跡累計(jì)附近毛發(fā)=4).遠(yuǎn)端結(jié)腸組織切片經(jīng)HE染色病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下(0-6分,綜合炎細(xì)胞浸潤(rùn)和組織損傷)：固有層炎細(xì)胞浸潤(rùn)(零星分布炎細(xì)胞=0；炎細(xì)胞數(shù)增加=1；炎細(xì)胞融合至粘膜下層=2；透壁浸潤(rùn)=3)；組織損傷(粘膜無(wú)損傷=1；上皮細(xì)胞損傷=1；粘膜表面潰瘍=2；粘膜廣泛損傷并累計(jì)深層組織=3)。 5.骨髓嵌合小鼠的產(chǎn)生 從表達(dá)CD45.1的野生型小鼠和表達(dá)CD45.2的Tipe-/-小鼠的股骨和脛骨收集骨髓細(xì)胞,經(jīng)尾靜脈將一百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞／每只小鼠轉(zhuǎn)輸給4.5Gy亞致死劑量照射的野生型小鼠和Tipe-/-小鼠,共產(chǎn)生四組嵌合小鼠：WT→WT(野生型細(xì)胞表達(dá)CD45.2轉(zhuǎn)輸給野生型細(xì)胞表達(dá)CD45.1)；Tipe-/-→WT(Tipe-/-細(xì)胞表達(dá)CD45.2轉(zhuǎn)輸給野生型細(xì)胞表達(dá)CD45.1)；WT→Tipe-/-(野生型細(xì)胞表達(dá)CD45.1轉(zhuǎn)輸給Tipe-/-細(xì)胞表達(dá)CD45.2；Tipe-/-→Tipe-/-(Tipe-/-細(xì)胞表達(dá)CD45.2轉(zhuǎn)輸給Tipe-/-細(xì)胞表達(dá)CD45.2).六周之后,以PE標(biāo)記的抗體CD45.1和PercpCy5.5標(biāo)記的抗體CD45.2用外周血白細(xì)胞檢測(cè)小鼠嵌合程度。 6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR 提取新鮮組織或者細(xì)胞總RNA并用2微克RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)基因的表達(dá),用GAPDH作為內(nèi)參計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)。 7.ELISA 血清標(biāo)本凍存于-80℃度備用。結(jié)腸組織標(biāo)本在混有蛋白酶抑制劑的裂解液中充分裂解后,用BCA法測(cè)定蛋白濃度,細(xì)胞因子的含量表示為pg／mg組織總蛋白。按照說(shuō)明書實(shí)施定量ELISA操作。 8.組織病理學(xué)和免疫組化 取出整個(gè)結(jié)腸并測(cè)量長(zhǎng)度后,清洗遠(yuǎn)端結(jié)腸,固定于10%福爾馬林,石蠟包埋。石蠟切片分別HE染色,Ki67染色和活化的caspase3染色。 9.分離結(jié)腸上皮細(xì)胞 分離結(jié)腸,用冷PBS沖洗并切成小塊,將切成小段的結(jié)腸在含有EDTA/DTT的緩沖液中37℃緩慢搖動(dòng)30分鐘,用70微米的濾器過(guò)濾上清液獲取單細(xì)胞懸液。經(jīng)上皮細(xì)胞特異性的抗體EpCam染色后確定,約70-80%的細(xì)胞都是EpCam陽(yáng)性的結(jié)腸上皮細(xì)胞。根據(jù)需要,分離的結(jié)腸上皮細(xì)胞在上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)。 10.分離結(jié)腸白細(xì)胞分離結(jié)腸固有層白細(xì)胞,首先將切成小段的結(jié)腸在含有EDTA/DTT的緩沖液中37℃搖動(dòng)30分鐘去除上皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞層中的淋巴細(xì)胞。將剩余的結(jié)腸切成小塊置于含有膠原酶,DNA酶和中性蛋白酶中37℃緩慢柔和搖動(dòng)20分鐘,用70微米的濾器過(guò)濾上清液獲取的單細(xì)胞懸液即含有白細(xì)胞。 11.凋亡分析 分離結(jié)腸提取結(jié)腸上皮細(xì)胞,在上皮細(xì)胞培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng),用DSS處理,24小時(shí)以后7AAD和Annexin V染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡。 12.細(xì)菌培養(yǎng) 取遠(yuǎn)端結(jié)腸約3厘米,沖洗、稱重、勻漿并梯度稀釋,將不同稀釋度的勻漿液涂于Brain Heart Infusion (BHI)瓊脂板和Blood瓊脂板上,37℃孵育過(guò)夜后計(jì)算細(xì)菌克隆形成數(shù)量。 13.腸道通透性檢測(cè) 用FITC標(biāo)記的葡聚糖檢測(cè)體內(nèi)腸道的通透性。WT和TIPE2-/-小鼠過(guò)夜禁食后經(jīng)口腔罐服通透性示蹤劑FITC標(biāo)記的葡聚糖,用量為400mg/kg,四小時(shí)之后經(jīng)內(nèi)眥取血,血清中的熒光強(qiáng)度用激發(fā)波長(zhǎng)為490nm、發(fā)射波長(zhǎng)為530nm的熒光分光光度計(jì)測(cè)定,用梯度稀釋的葡聚糖構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算血清中的濃度。 14.血細(xì)胞計(jì)數(shù) 處理小鼠之前,收集血液,用Drew Hemavet950FS儀器讀取全血細(xì)胞數(shù)。 研究結(jié)果 1.Tipe基因缺陷小鼠的產(chǎn)生及表型 利用基因誘騙技術(shù)在B6胚胎干細(xì)胞中靶向Tipe基因產(chǎn)生Tipe基因缺陷小鼠,誘騙載體包含病毒長(zhǎng)末端重復(fù)基序、剪接受體位點(diǎn)、新霉素抗性基因和終止Tipe基因轉(zhuǎn)錄的多聚A尾。此靶向Tipe基因的表達(dá)導(dǎo)致短片段TIPE表達(dá)完全缺失,長(zhǎng)片段Tipe僅表達(dá)氮末端前24個(gè)氨基酸,純合子的產(chǎn)生用PCR技術(shù)進(jìn) 一步確認(rèn)。Tipe基因缺陷并不明顯影響小鼠的生長(zhǎng)和發(fā)育,Tipe-/-小鼠的繁殖符合孟德爾遺傳規(guī)律,無(wú)明顯發(fā)育不良問(wèn)題。淋巴器官的重量、結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成正常。有研究報(bào)道下調(diào)Tipe基因的表達(dá)抵抗糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞的凋亡,但是,地塞米松誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞的凋亡WT小鼠和Tipe-/-小鼠并無(wú)明顯差異。 2.Tipe-/-小鼠易感DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎 與WT小鼠相比,Tipe-/-小鼠沒(méi)有明顯的自發(fā)性疾病。但是DSS處理以后,盡管與WT小鼠飲用水的消耗相似,Tipe-/-小鼠的疾病程度明顯加重,Tipe-/-小鼠第六天開始出現(xiàn)死亡,到第十天所有Tipe-/-小鼠全部死亡而40%的WT小鼠存活下來(lái)(p0.01)。Tipe-/-小鼠體重丟失的嚴(yán)重程度明顯高于WT對(duì)照組(p0.05)。與此結(jié)果相一致,Tipe-/-小鼠的臨床疾病活動(dòng)指數(shù)也明顯高于WT小鼠(p0.01)。此外,DSS處理以后,Tipe-/-小鼠結(jié)腸重量比WT小鼠少(p0.05)而結(jié)腸長(zhǎng)度比WT小鼠短(p0.05)。組織病理學(xué)檢測(cè)顯示Tipe-/-小鼠結(jié)腸部位的炎細(xì)胞浸潤(rùn)和粘膜破壞程度也明顯比WT小鼠重。3.Tipe-/-小鼠炎癥應(yīng)答增強(qiáng) 為了進(jìn)一步明確Tipe在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎中的作用,我們用年齡和性別匹配的WT小鼠和Tipe-/-小鼠檢測(cè)疾病相關(guān)的血液學(xué)指標(biāo)和免疫學(xué)指標(biāo)。DSS處理以后,與WT小鼠相比,Tipe-/-小鼠血液中的中心粒細(xì)胞數(shù)量明顯升高(p0.05),同時(shí),Tipe-/-小鼠結(jié)腸中浸潤(rùn)的白細(xì)胞數(shù)量(p0.01)也明顯增加而脾臟相對(duì)變小(p0.05)。Tipe-/-小鼠血清中IL-6和IL-17的含量也明顯增加(p0.001),與此相似,Tipe-/-小鼠結(jié)腸局部IL-6,IL-17A和IL-1β在蛋白水平(p0.001)和mRNA水平(p0.05)的表達(dá)增強(qiáng),趨化性細(xì)胞因子CXCL2mRNA表達(dá)水平在Tipe-/小鼠的結(jié)腸內(nèi)也明顯增加(p0.05)。4.Tipe在非造血細(xì)胞缺陷加重結(jié)腸炎 盡管DSS處理的Tipe-/-小鼠加重炎癥應(yīng)答,造血系統(tǒng)和非造血系統(tǒng)都可能導(dǎo)致加重結(jié)腸炎這一表型。為了明確哪一部分起作用,我們利用骨髓移植技術(shù)產(chǎn)生四組嵌合小鼠。重組八周以后誘導(dǎo)結(jié)腸炎,接受WT和Tipe-/-骨髓細(xì)胞的受體WT的體重、疾病活動(dòng)指數(shù)和結(jié)腸長(zhǎng)度并無(wú)明顯差異(p0.05),提示造血細(xì)胞在Tipe-/-小鼠結(jié)腸炎表型中并不發(fā)揮主要作用。相反,與接受WT骨髓細(xì)胞的WT受體小鼠相比,接受WT骨髓細(xì)胞的Tipe-/-受體小鼠發(fā)生了更嚴(yán)重的結(jié)腸炎(p0.05),提示非造血細(xì)胞在Tipe-/-小鼠結(jié)腸炎表型中發(fā)揮主要作用。5.Tipe/-小鼠結(jié)腸組織中細(xì)菌侵入增加 腸道上皮細(xì)胞損傷破壞粘膜屏障能導(dǎo)致腸道內(nèi)的細(xì)菌侵入組織并引發(fā)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答,這也被認(rèn)為是DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎發(fā)病的重要原因之一。我們接下來(lái)檢測(cè)DSS處理以后WT小鼠和Tipe-/小鼠結(jié)腸內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量,發(fā)現(xiàn)Tipe-/-小鼠結(jié)腸內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量明顯高于WT對(duì)照小鼠(p0.05),提示腸道內(nèi)的細(xì)菌播散增強(qiáng)。 6.Tipe基因缺陷影響上皮細(xì)胞的凋亡和增殖 在結(jié)腸炎的發(fā)生過(guò)程中,結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡增加和／或增殖降低可能能夠解釋Tipe-/-小鼠死亡率增加的表型。為了檢測(cè)Tipe基因缺陷是否影響結(jié)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞死亡或增殖,從正常小鼠和DSS處理小鼠結(jié)腸中提取上皮細(xì)胞,AnnexinV和7AAD染色檢測(cè)細(xì)胞死亡。與WT對(duì)照組相比,Tipe-/-小鼠細(xì)胞死亡增加(p0.05)。另外,Tipe/-小鼠結(jié)腸組織中活化的AKT降低,提示增加的細(xì)胞死亡可能是降低了P13K-AKT的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Ki67是細(xì)胞增殖的內(nèi)源性marker,Ki67免疫組化染色發(fā)現(xiàn),與WT小鼠相比,Tipe-/-小鼠結(jié)腸組織內(nèi)Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減低(p0.001),提示DSS損傷以后,上皮細(xì)胞的增殖修復(fù)需要TIPE的參與。此外,Tipe-/-小鼠結(jié)腸組織內(nèi)活化形式的caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增加(p0.001)。綜上所述,Tipe-/-小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞死亡增多,繼而增殖能力受損,可能是導(dǎo)致DSS損傷以后死亡率增加的原因。 結(jié)論 1.Tipe基因缺陷不影響胸腺T細(xì)胞的發(fā)育,Tipe基因缺陷不影響地塞米松誘導(dǎo)的胸腺細(xì)胞的凋亡； 2.Tipe-/-小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎高度敏感； 3.Tipe在非造血細(xì)胞缺陷加重結(jié)腸炎的發(fā)病程度； 4.Tipe可能通過(guò)調(diào)節(jié)結(jié)腸上皮細(xì)胞的凋亡和增殖參與結(jié)腸炎的發(fā)生。 創(chuàng)新點(diǎn)及意義 1.首次構(gòu)建Tipe-/-小鼠并探討其表型； 2.本研究首次發(fā)現(xiàn)TNFAIP8家族成員Tipe在結(jié)腸炎發(fā)生中的作用,為進(jìn)一步探討Tipe在病理生理?xiàng)l件下的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)； 3.本研究初步闡明Tipe參與結(jié)腸炎發(fā)生的作用機(jī)制,可能為干預(yù)結(jié)腸炎的臨床治療提供潛在靶點(diǎn)。 炎癥性腸道疾病(inflammatory bowel diseases, IBD)包括潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn's氏病是嚴(yán)重威脅人類健康具有潛在結(jié)腸和直腸致癌風(fēng)險(xiǎn)的疾病。潰瘍性結(jié)腸炎呈現(xiàn)遠(yuǎn)端結(jié)腸并累及直腸的慢性、經(jīng)治療短暫緩解并反復(fù)發(fā)作的炎癥性疾病特點(diǎn),通常認(rèn)為是結(jié)腸局部菌群和粘膜處免疫細(xì)胞異常相互作用導(dǎo)致的免疫紊亂。過(guò)度免疫應(yīng)答產(chǎn)生的炎癥介質(zhì)是人類IBD和實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的致病元兇。目前結(jié)腸炎精確的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,而實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型的建立有益于探索疾病發(fā)生的細(xì)胞分子機(jī)制。其中,葡聚糖硫酸酯鈉鹽(dextran sodium sulfate, DSS)誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型是最常用的模型之一。DSS誘導(dǎo)腸道粘膜上皮細(xì)胞損傷,破壞粘膜屏障,腸道細(xì)菌與髓系免疫細(xì)胞接觸引起急性免疫應(yīng)答。DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎與人類IBD有許多相似之處,如局限于結(jié)腸粘膜、體重減輕、腹瀉、便血和結(jié)腸潰瘍,組織病理學(xué)特點(diǎn)是存在廣泛炎癥,伴有大量巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。 TIPE2,腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的蛋白8-2(Tumor necrosis factor-a induced protein-8-like2),是TNFAIP8家族的成員,選擇性表達(dá)于炎癥組織、胸腺、脾臟、淋巴結(jié)、小腸粘膜等免疫器官和淋巴組織中以及造血細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn),TIPE2通過(guò)負(fù)性調(diào)節(jié)機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答維持免疫穩(wěn)態(tài)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),TIPE2的異常表達(dá)與自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病、感染性疾病、代謝性疾病以及腫瘤的發(fā)生有關(guān)。另外,我們前期試驗(yàn)結(jié)果表明TIPE2通過(guò)作用于RacGTPases調(diào)節(jié)抗病毒和抗細(xì)菌固有免疫應(yīng)答。然而,目前尚無(wú)報(bào)道TIPE2在IBD發(fā)生中的作用,鑒于IBD是細(xì)菌依賴性疾病,我們提出如下假說(shuō)：TIPE2通過(guò)調(diào)節(jié)腸道抗細(xì)菌免疫應(yīng)答在IBD的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 研究目的 探討TIPE2在DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎模型中的作用及其機(jī)制 研究方法 參考第一部分 研究結(jié)果 1.TIPE家族成員在小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá) 我們首先檢測(cè)TIPE2-/-小鼠結(jié)腸組織的表型,研究發(fā)現(xiàn)129S6/SvEvTac背景的TIPE2-/-小鼠約從八周開始出現(xiàn)自發(fā)性系統(tǒng)性炎癥,而C57BL/6背景的TIPE2-／-小鼠則相對(duì)健康,無(wú)自發(fā)性IBD,腸道結(jié)構(gòu)正常。在WT而非TIPE2-/-小鼠結(jié)腸組織中很容易檢測(cè)到TIPE2mRNA的表達(dá),在整個(gè)家族成員中,TIPE和TIPE1的表達(dá)比TIPE2的表達(dá)較高,而TIPE3的表達(dá)最低。另外,TIPE2-/-小鼠結(jié)腸組織中其它成員的表達(dá)水平與WT小鼠相似。2.TIPE2-/-小鼠抵抗DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎 在WT小鼠和TIPE2-/-小鼠的飲用水中加入4%DSS誘導(dǎo)急性結(jié)腸炎,發(fā)現(xiàn)TIPE2基因缺陷并不影響飲用水的消耗,然而TIPE2-/-小鼠的發(fā)病程度則明顯減低。生存實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),80%的WT小鼠死亡而TIPE2-/-小鼠全部存活(p0.01)。從第五天開始,TIPE2-/-小鼠體重丟失的嚴(yán)重程度明顯低于WT對(duì)照組(p0.05)。與此結(jié)果相一致,TIPE2-／-小鼠的臨床疾病活動(dòng)指數(shù)也明顯低于WT小鼠(p0.01)。此外,DSS處理以后,TIPE2-/-小鼠結(jié)腸重量比WT小鼠多23%(p0.01),TIPE2-/-小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度比WT小鼠長(zhǎng)27%(p0.01)。組織病理學(xué)檢測(cè)顯示TIPE2-/-小鼠結(jié)腸部位的炎細(xì)胞浸潤(rùn)和粘膜破壞程度也明顯比WT小鼠輕,定量組織病理學(xué)評(píng)分結(jié)果顯示TIPE2-/-小鼠也明顯低于WT小鼠(4.6±0.6v.s2.6±0.4,p0.05)。 3.TIPE2-/-小鼠結(jié)腸局部炎癥降低 為了闡明TIPE2缺陷以后對(duì)結(jié)腸局部細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響,我們檢測(cè)了幾種細(xì)胞因子的表達(dá)。DSS處理以后,WT小鼠結(jié)腸局部產(chǎn)生的促炎性細(xì)胞因子TNF-α,IL-6和IL-12明顯升高,然而,相對(duì)于WT小鼠來(lái)說(shuō),TIPE2-/-小鼠產(chǎn)生的這些細(xì)胞因子則相對(duì)較低。其它細(xì)胞因子如IL-1β,IL-4和IFN-γ兩組之間無(wú)明顯差異。進(jìn)一步分析結(jié)腸固有層內(nèi)浸潤(rùn)的白細(xì)胞發(fā)現(xiàn)TIPE2-/-小鼠結(jié)腸內(nèi)的中性粒細(xì)胞數(shù)(8.89±0.55v.s.2.92±0.32,p0.001)、巨噬細(xì)胞數(shù)(12.63±0.63v.s.6.92±0.69,p0.001)和樹突狀細(xì)胞數(shù)(24.04±3.65v.s.11.97±0.27,p0.05),相對(duì)于WT小鼠來(lái)說(shuō)均明顯降低。值得注意的是,在WT小鼠和TIPE2-/-小鼠結(jié)腸內(nèi)浸潤(rùn)的白細(xì)胞中Ly6G-CD11b+巨噬細(xì)胞是重要的細(xì)胞群體,而中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞則是相對(duì)較少的細(xì)胞群體。 4.TIPE2在造血細(xì)胞缺陷減輕結(jié)腸炎 為了闡明哪類細(xì)胞在TIPE2介導(dǎo)的效應(yīng)里發(fā)揮重要作用,我們利用骨髓移植技術(shù)產(chǎn)生四組嵌合小鼠。移植六周以后,我們發(fā)現(xiàn)受體小鼠90%以上的外周血白細(xì)胞來(lái)源于供體小鼠,證實(shí)嵌合成功。經(jīng)DSS處理以后,KO→KO嵌合小鼠發(fā)病最輕。與WT→WT嵌合小鼠相比,KO→WT嵌合小鼠體重丟失減輕,DAI改善,保留結(jié)腸長(zhǎng)度增加,組織病理學(xué)分?jǐn)?shù)降低,這些結(jié)果提示TIPE2在造血細(xì)胞缺陷降低結(jié)腸炎的疾病程度。 5.TIPE2-/-小鼠降低局部細(xì)菌播散和系統(tǒng)性炎癥 TIPE2-/-小鼠結(jié)腸局部的炎癥應(yīng)答減低,那么TIPE2是否影響到腸道細(xì)菌的擴(kuò)散。DSS處理以后,相對(duì)于WT小鼠,TIPE2-/-小鼠結(jié)腸內(nèi)細(xì)菌數(shù)明顯減低,同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)TIPE2-／-小鼠血清中的FITC-dextran的熒光強(qiáng)度降低(p0.05),提示TIPE2-/-小鼠結(jié)腸組織破壞和通透性較輕。與降低局部細(xì)菌播散相一致,TIPE2-/-小鼠外周血的白細(xì)胞總數(shù)(p0.05)和單核細(xì)胞數(shù)(p0.001)與WT小鼠相比也顯著降低。另外,TIPE2-/-小鼠血清中促炎性細(xì)胞因子IL-6的含量也明顯減少(p0.001)。 6.TIPE2基因缺陷不影響腸道菌群 我們提取小鼠糞便基因組DNA,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品用絕對(duì)定量的方法檢測(cè)腸道內(nèi)總的細(xì)菌量,接著用特異性的16S rRNA引物擴(kuò)增三種代表性的細(xì)菌theEubacterium rectale-Clostridium coccoides, Bacteroides sp.和Enterobacteriaceae并絕對(duì)定量。我們發(fā)現(xiàn)與6至8周的WT小鼠相比,TIPE2-／-小鼠腸道內(nèi)總的細(xì)菌含量和三種代表性的細(xì)菌含量并無(wú)明顯差異,提示TIPE2基因缺陷不影響腸道菌群的結(jié)構(gòu)和含量。 結(jié)論 1.在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中,TIPE2-/-小鼠的發(fā)病程度明顯降低； 2.轉(zhuǎn)輸TIPE2基因缺陷的骨髓細(xì)胞能夠明顯拯救WT小鼠的結(jié)腸損傷程度； 3.TIPE2-/-小鼠抵抗DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎與降低結(jié)腸局部細(xì)菌的播散和系統(tǒng)性炎癥有關(guān)。 創(chuàng)新點(diǎn)及意義 1.首次研究抗炎蛋白TIPE2在結(jié)腸炎模型中的作用,進(jìn)一步拓展對(duì)TIPE2在不同疾病模型中作用的認(rèn)識(shí)； 2.本研究進(jìn)一步證實(shí)了腸道菌群在結(jié)腸炎發(fā)生中的重要作用,通過(guò)控制腸道局部細(xì)菌的繁殖和播散可能會(huì)有效控制結(jié)腸炎的發(fā)生； 3.本研究進(jìn)一步闡明了結(jié)腸炎的炎癥免疫機(jī)制,為免疫干預(yù)結(jié)腸炎的臨床治療提供了潛在靶點(diǎn)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R574.62

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本文編號(hào)：1506172