本文關(guān)鍵詞： 探頭式共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(pCLE) 熒光素鈉 劑量 皮膚黃染 胃腸上皮化生　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景第一部分：小劑量熒光素鈉對(duì)共聚焦顯微內(nèi)鏡圖像質(zhì)量及患者膚色的影響內(nèi)鏡檢查是目前早期發(fā)現(xiàn)和診斷消化道疾病的最有效方法�，F(xiàn)階段先進(jìn)的內(nèi)鏡設(shè)備如放大內(nèi)鏡、色素內(nèi)鏡和窄帶成像內(nèi)鏡在提高消化道早癌的診斷和檢出效能方面已有突飛猛進(jìn)的進(jìn)展。放大內(nèi)鏡與染色內(nèi)鏡結(jié)合后通過(guò)對(duì)病變部位黏膜表層細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)微改變的識(shí)別來(lái)提高活檢的準(zhǔn)確率。然而,上述內(nèi)鏡檢查方法均局限于對(duì)消化道黏膜表層細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的觀察,最終診斷仍然依靠病理組織學(xué)活檢。探頭式共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(probe-based confocal laser endomicroscopy, pCLE)是近年來(lái)內(nèi)鏡技術(shù)的新發(fā)展,該內(nèi)鏡將共聚焦激光顯微鏡與傳統(tǒng)內(nèi)鏡相結(jié)合,在熒光素鈉的作用下,可以在普通白光內(nèi)鏡檢查的同時(shí),對(duì)觀察部位的消化道黏膜進(jìn)行單點(diǎn)逐層深入掃描,通過(guò)圖像同步處理系統(tǒng)成像,實(shí)時(shí)觀測(cè)消化道黏膜表層及粘膜下250μm的橫斷面結(jié)構(gòu)形態(tài),可獲得放大1000倍的高分辨率熒光圖像,從而使消化內(nèi)鏡實(shí)現(xiàn)了“光學(xué)活檢”,該技術(shù)的應(yīng)用明顯提高了消化道黏膜病變的診斷準(zhǔn)確率,也減少了盲目活檢的數(shù)量。絕大多數(shù)的消化道黏膜病變?nèi)绯Ｒ?jiàn)的凹陷型和隆起型病變,能夠通過(guò)普通白光內(nèi)鏡檢查被發(fā)現(xiàn),但是平坦型病變?cè)趥鹘y(tǒng)內(nèi)鏡下常呈隱匿表現(xiàn),極易被誤診或漏診。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(CLE)實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)“光學(xué)活檢”的可能,能夠?qū)ο勒衬げ∽冞M(jìn)行實(shí)時(shí)在體的組織病理學(xué)活檢,極大的提高了各種消化道病變,特別是隱匿型病變的檢出率。pCLE這種新型內(nèi)鏡在觀察消化道黏膜顯微結(jié)構(gòu)實(shí)行靶向活檢時(shí),需要通過(guò)組織內(nèi)強(qiáng)烈的熒光基團(tuán)實(shí)現(xiàn)成像,因此需要在內(nèi)鏡檢查的同時(shí)靜脈注射或在黏膜表面噴灑熒光物質(zhì)作為顯影對(duì)比劑。由于熒光素鈉使用簡(jiǎn)便,熒光特性優(yōu)越,無(wú)致畸作用,價(jià)格低廉,并發(fā)癥少見(jiàn)使得其成為共聚焦顯微內(nèi)鏡中最常用的顯影劑,且在眼科手術(shù)中已應(yīng)用數(shù)十年。靜脈應(yīng)用熒光素鈉的傳統(tǒng)劑量為10%熒光素鈉5-10ml,該劑量可保證獲得高質(zhì)量的清晰圖像,但患者的皮膚及尿液黃染均非常明顯。熒光素鈉的半衰期為24小時(shí),雖然通過(guò)大量飲水熒光素鈉可逐漸代謝,黃染逐漸消退,但該表現(xiàn)仍嚴(yán)重的影響了被檢查者的日常生活及工作。我們?cè)陬A(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)很多情況下應(yīng)用小于傳統(tǒng)劑量的熒光素鈉時(shí)亦可獲得清晰的共聚焦內(nèi)鏡圖像,例如10%熒光素鈉2ml、lml,甚至0.5ml有時(shí)亦可看清楚組織結(jié)構(gòu)。第二部分小劑量熒光素鈉在胃腸上皮化生診斷中的作用胃癌發(fā)病率較高,是世界排名第二的消化道惡性腫瘤,死亡率為男性16.3/10萬(wàn),女性7.9/10萬(wàn)。中國(guó)屬胃癌高發(fā)國(guó)家,一般認(rèn)為胃癌的發(fā)生是一個(gè)與遺傳因素、環(huán)境因素及幽門(mén)螺桿菌的感染有關(guān)的多步驟、多因素演變的過(guò)程。胃癌的發(fā)展演變包括以下幾個(gè)過(guò)程：慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎(Atrophic Gastritis, AG)、胃粘膜腸上皮化生(gastric intestinal metaplasia, GIM)、不典型增生(atypical hyperplasia),高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變(high-grade intraepithelial neoplasia, HGIN),最終發(fā)展為胃癌,其中萎縮性胃炎、腸上皮化生和不典型增生被稱為癌前病變。胃黏膜腸上皮化生(GIM)是指在病理情況下,胃粘膜上皮和(或)腺上皮被類似腸粘膜上皮和(或)腺上皮所代替。胃黏膜腸上皮化生是發(fā)生腸型胃癌的高危因素之一,被公認(rèn)為癌前病變,也稱為癌前期狀態(tài)。其病變的程度與胃粘膜細(xì)胞的異型增生頻率及胃黏膜萎縮的程度相關(guān),若能早期發(fā)現(xiàn)并診斷GIM,使其病變得到及時(shí)治療甚至逆轉(zhuǎn),則可使胃癌得到更早、更有效的治療。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡在早期診斷胃癌和GIM方面優(yōu)勢(shì)顯著,其臨床價(jià)值已得到證實(shí)。細(xì)胞癌變?cè)谛螒B(tài)學(xué)上主要依靠出現(xiàn)異型增生的核分裂像來(lái)識(shí)別。識(shí)別化生的腸上皮,主要依靠其形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)絨毛狀胃小凹上皮、潘氏細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、吸收細(xì)胞或通過(guò)粘液染色來(lái)識(shí)別,正常情況下上述細(xì)胞及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)只能在顯微鏡下通過(guò)組織病理切片染色后才能觀察到,而在普通內(nèi)鏡下不能直接觀察到。pCLE可以得到放大1000倍的組織熒光圖像,可直接顯示上述微型細(xì)胞、血管及細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)。由于病理切片需對(duì)病變組織進(jìn)行固定、脫水等一系列處理,這就使顯微鏡下觀察到的組織與活體組織有明顯不同。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡實(shí)現(xiàn)了在體觀察及診斷,根據(jù)相關(guān)研究成果制定的消化道疾病形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn),共聚焦顯微內(nèi)鏡能夠較為準(zhǔn)確的診斷和鑒別消化道黏膜是否存在癌變,在消化道腫瘤早期診療方面優(yōu)勢(shì)極大。第一部分研究中,我們排除了各種嚴(yán)重的黏膜病變的干擾而且所有患者做的是上消化道內(nèi)鏡檢查,胃腸道各個(gè)臟器由于影響熒光素鈉分布和釋放的上皮細(xì)胞類型、血供、粘膜層厚度及通透性不同,最佳的熒光素鈉劑量亦可能不同,我們研究只探討適用于正常胃竇黏膜的最佳熒光素鈉劑量,此較佳劑量是否也適用于胃黏膜腸上皮化生、消化性潰瘍、消化道腫瘤、嚴(yán)重的胃炎和胃腸道其他部位諸如下消化道結(jié)腸和直腸黏膜將在后續(xù)研究中進(jìn)行。研究目的(1)保證共聚焦顯微內(nèi)鏡清晰的圖像質(zhì)量的前提下獲得無(wú)肉眼可見(jiàn)的皮膚黃染的最佳熒光素鈉劑量。(2)將10%熒光素鈉0.02ml/kg與傳統(tǒng)的熒光素鈉劑量0.1ml/kg同時(shí)應(yīng)用于胃腸上皮化生的診斷中,用于比較二者的診斷準(zhǔn)確性,從而證明小劑量熒光素鈉也適用于胃腸上皮化生的鑒別診斷。研究方法第一部分：小劑量熒光素鈉對(duì)共聚焦顯微內(nèi)鏡圖像質(zhì)量及患者膚色的影響自2015年8月至2015年9月,在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院內(nèi)鏡中心進(jìn)行胃鏡檢查的所有符合要求的病人均納入本研究。檢查前20分鐘給予1%熒光素鈉1ml行皮試檢查,對(duì)熒光素鈉過(guò)敏患者不納入該研究。國(guó)際上應(yīng)用的常規(guī)劑量為10%熒光素鈉5ml,換算成0.10ml/kg作為本研究分組的上限,選0.01ml/kg作為本實(shí)驗(yàn)劑量分組的下限,中間選擇0.05ml/kg,0.02ml/kg兩個(gè)劑量組。根據(jù)EXCEL產(chǎn)生的隨機(jī)數(shù)字表將患者隨機(jī)分為4組并給予相應(yīng)劑量的熒光素鈉。2位具有豐富消化內(nèi)鏡操作及診斷經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師(于濤、顧曉萌)參與了本課題中探頭式熒光共聚焦激光顯微內(nèi)鏡(pCLE)的操作過(guò)程。操作醫(yī)師對(duì)患者的熒光素鈉劑量分組情況均不知情,所有內(nèi)鏡操作過(guò)程由一名助理進(jìn)行監(jiān)督并記錄。選取胃鏡下正常胃竇大彎中線距幽門(mén)3-4cm處為觀察點(diǎn),一旦沒(méi)有嚴(yán)重疾病的胃竇清晰暴露后,助手根據(jù)病人不同分組情況迅速靜脈注入不同劑量的熒光素鈉,分別錄制1分鐘、5分鐘、10分鐘、15分鐘及20分鐘的共聚焦圖像視頻。檢查者對(duì)每位患者所應(yīng)用的熒光素鈉劑量均不知曉。所有pCLE的視頻文件均自動(dòng)儲(chǔ)存為.mkt (Cellvizio Viewer格式)。邀請(qǐng)2位具有豐富共聚焦內(nèi)鏡操作經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師(左秀麗、李長(zhǎng)青)根據(jù)組織細(xì)胞、血管結(jié)構(gòu)、上皮細(xì)胞是否與胞漿清晰可辨來(lái)進(jìn)行主觀評(píng)價(jià),在主觀評(píng)價(jià)前,對(duì)所有的共聚焦圖像在不考慮患者分組及熒光素鈉的劑量情況下打亂順序進(jìn)行隨機(jī)分布,評(píng)分者對(duì)每張圖片信息及評(píng)分者相互之間的評(píng)價(jià)均不知曉。pCLE圖像分為3個(gè)等級(jí),差：看不清楚組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)；中：可以看清組織細(xì)胞結(jié)構(gòu),但圖像背景較黑；優(yōu)：可以清楚的顯示組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)。主觀評(píng)價(jià)者分別按照2/3圖像認(rèn)定為差、中、優(yōu)而記為1,2,3分。得分越高代表圖像越清晰。為了評(píng)估觀察者間一致性,2周后,將共聚焦內(nèi)鏡圖像再次隨機(jī)打亂順序,另1位經(jīng)驗(yàn)豐富的內(nèi)鏡醫(yī)師(季銳)再次對(duì)這些內(nèi)鏡圖像進(jìn)行打分,該內(nèi)鏡醫(yī)師不知道前次打分中各醫(yī)師的診斷結(jié)果,記錄該醫(yī)師的打分結(jié)果。pCLE圖像客觀評(píng)價(jià)采用信噪比SNR作為客觀評(píng)價(jià)指標(biāo),信噪比是電子工程學(xué)的一個(gè)參數(shù),定義為圖像信號(hào)強(qiáng)度與干擾圖像的噪聲之間的比值,比值高于1：1表明圖像信號(hào)高于噪聲干擾,后期處理圖像時(shí)所有的圖像順序被打亂,應(yīng)用matlab2013b軟件直接計(jì)算出信噪比,這個(gè)軟件甚至可以對(duì)模糊的圖像給出客觀公正的信噪比數(shù)值,每個(gè)單獨(dú)的信噪比值被記錄用來(lái)計(jì)算這個(gè)圖像的平均信噪比值,以客觀真實(shí)的反映該圖像的清晰程度。為了檢測(cè)患者靜脈應(yīng)用不同劑量的熒光素鈉后皮膚黃染程度的變化,參與本研究的患者分別于檢查前和檢查后1小時(shí)于新生兒科應(yīng)用經(jīng)皮黃疸儀(NJ33-wuhan, China)行黃疸檢測(cè)。將經(jīng)皮黃疸儀分別對(duì)準(zhǔn)患者的前額、眼角及前胸三個(gè)部位,儀器顯示的數(shù)值即為黃疸值。所有的數(shù)據(jù)儲(chǔ)存于固定的文件夾內(nèi)備后續(xù)分析。第二部分小劑量熒光素鈉在胃腸上皮化生診斷中的作用自2015年9月至2015年11月,將在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院內(nèi)鏡中心進(jìn)行胃鏡檢查的符合要求的所有病人參與本研究�；颊唠S機(jī)分為兩組,靜脈給予傳統(tǒng)劑量的熒光素鈉(0.10ml/kg,A組)和第一部分研究所得的小劑量熒光素鈉(0.02ml/kg, B組)。所有患者均先接受普通高清白光內(nèi)鏡(EPK-i10內(nèi)鏡,Pentax)檢查,仔細(xì)觀察所有上消化道臟器(食管、胃、十二指腸)有無(wú)病變,若不伴有各種嚴(yán)重疾病,助手根據(jù)病人不同分組情況迅速靜脈注入不同劑量的熒光素鈉。通過(guò)高清白光內(nèi)鏡EPK-i10的活檢孔道置入共聚焦顯微內(nèi)鏡的微探頭,按新悉尼標(biāo)準(zhǔn)觀察五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)部位(距離幽門(mén)口3cm處的胃竇大彎、小彎,距離胃角4cm的胃體小彎、胃體大彎中點(diǎn)及胃角)及肉眼可見(jiàn)病變,仔細(xì)觀察肉眼可見(jiàn)病變及正常黏膜,當(dāng)共聚焦圖像顯示視野內(nèi)存在杯狀細(xì)胞時(shí)即取靶向活檢,同時(shí)所有的肉眼可見(jiàn)病變均取活檢。所取的活檢標(biāo)本立即以10%福爾馬林溶液固定,送病理科經(jīng)石蠟包埋后,將石蠟標(biāo)本橫切和縱切成4μm的組織切片,常規(guī)HE染色后將病理切片圖像及診斷結(jié)果與共聚焦內(nèi)鏡所拍攝的組織圖像進(jìn)行對(duì)比。研究結(jié)果第一部分：小劑量熒光素鈉對(duì)共聚焦顯微內(nèi)鏡圖像質(zhì)量及患者膚色的影響1.患者的臨床特征共有63名患者納入本研究,31名為男性患者(49.21%),32名為女性患者(50.79%)。所有患者按照EXCEL的隨機(jī)數(shù)字序列表隨機(jī)分為四組,A組(0.01ml／kg)：17人,B組(0.02ml/kg)：15人,C組(0.05ml/kg):16人,D組(0.10ml/kg)：15人。四組的平均年齡是：A組,52.40歲(95%可信區(qū)間,47.31-57.49)；B組,48.94歲(95%可信區(qū)間,42.18-55.71)；C組,45.44歲(95%可信區(qū)間,39.58-51.29)；D組,48.65歲(95%可信區(qū)間,42.16-55.13)。四組患者的年齡無(wú)顯著性差異(P=0.449)。四組患者間性別差別是：A組,男性52.94%,女性47.06%；B組,男性46.67%,女性53.33%；C組,男性37.5%,女性62.5%；D組,男性60%,女性40%。四組患者的性別無(wú)顯著性差別(P=0.635)。2.圖像質(zhì)量主觀評(píng)價(jià)63位患者參與本研究共獲得了1575張圖片,重復(fù)測(cè)量資料的方差分析顯示伴隨熒光素鈉劑量減少圖像質(zhì)量亦顯著降低(P0.0001)。任意2個(gè)相鄰劑量組的獨(dú)立樣本檢測(cè)顯示組A(0.01ml/kg)是四組中唯一顯著降低圖像質(zhì)量的一組。(組A與組B P=0.00；組B與組C P=0.236；組C與組DP=0.648)。圖中我們亦可看出伴隨時(shí)間的推移組A(0.01ml/kg)圖像質(zhì)量降低的最快,也就是說(shuō)組A(0.01ml/kg)熒光素鈉體內(nèi)代謝衰減最快。各組觀察者間一致性無(wú)差別,說(shuō)明該評(píng)價(jià)方法的可靠性較好。3.圖像質(zhì)量客觀評(píng)價(jià)伴隨熒光素鈉劑量的減少圖像信噪比數(shù)值亦顯著降低(P0.05)。任意2個(gè)獨(dú)立樣本間檢測(cè)顯示組C (0.05ml/kg)與組D (0.10ml/kg)之間無(wú)顯著性差異,而組A(0.01ml/kg)是唯一一個(gè)顯著降低圖像質(zhì)量的組(組A與組B,P=0.00；組A與組C,P=0.00；組A與組D,P=0.00；組B與組C,P=0.009；組B與組D,P=0.014；組C與組D,P=0.895)。組B(0.02ml/kg)的SNR數(shù)值最高,換句話說(shuō),按照0.02ml/kg靜脈推注10%熒光素鈉可獲得最清楚的圖像。4.給藥前后皮膚黃疸值的比較結(jié)果顯示只有組A (0.01ml/kg)與組B(0.02ml/kg)間無(wú)顯著性差異(P=0.148),而其他組間P0.05。組A與組B的平均黃疸值均小于數(shù)值2,我們進(jìn)一步將組A與組B的數(shù)值與數(shù)值2行t檢驗(yàn),結(jié)果顯示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.05,因此我們認(rèn)為按照0.01ml/kg或0.02ml/kg的劑量靜脈注射熒光素鈉無(wú)肉眼可見(jiàn)的皮膚黃染。第二部分小劑量熒光素鈉在胃腸上皮化生診斷中的作用最終共有410位患者參與了共聚焦內(nèi)鏡檢查,其中249位符合入組標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)最終參與了本研究(129,A組；120,B組)。所有參與研究的患者全程未發(fā)生熒光素鈉不良反應(yīng)和并發(fā)癥。A、B兩組患者在性別和年齡上沒(méi)有顯著差異。組織病理學(xué)診斷如下：120位患者檢出腸化(63,A組；57,B組),按照每個(gè)病人來(lái)計(jì)算,A、B兩組腸化的檢出率分別是48.84%(63/129)和47.5%(57/120)(P0.05)。就單個(gè)病變來(lái)說(shuō),共有318個(gè)肉眼可見(jiàn)病變被檢查。A組：152個(gè)肉眼可見(jiàn)病變中共取得175個(gè)靶向活檢,最后,63個(gè)病人中的109個(gè)部位病理組織學(xué)診斷為腸化。B組：166個(gè)肉眼可見(jiàn)病變中共取得184個(gè)活檢,最后,57個(gè)病人中的117個(gè)肉眼可見(jiàn)病變的病理組織學(xué)診斷為腸化。因此就單個(gè)肉眼可見(jiàn)病變來(lái)說(shuō),共聚焦激光顯微內(nèi)鏡靶向活檢可獲得較高的胃黏膜腸上皮化生的診斷檢出率(71.71%,109/152,A組；70.48%,117/166,B組),診斷的準(zhǔn)確率分別是A組：96%(168/175)；B組：95.11%(175/184)。共聚焦激光顯微內(nèi)鏡診斷A、B兩組的胃黏膜腸上皮化生的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別是96.40%和95.73%,95.31%和94.03%,97.27和96.55%,92.42%和92.65%。A、B兩組在共聚焦激光顯微內(nèi)鏡診斷胃黏膜腸上皮化生的準(zhǔn)確率上無(wú)顯著差異(P0.05)。A、B兩組的kappa值分別是0.867 (95%CI 0.782-0.952) and0.891 (95%CI 0.811-0.971)。研究結(jié)論第一部分：小劑量熒光素鈉對(duì)共聚焦顯微內(nèi)鏡圖像質(zhì)量及患者膚色的影響1.在上消化道共聚焦顯微內(nèi)鏡檢查中,與傳統(tǒng)應(yīng)用10%熒光素鈉5-l0ml相比,按10%熒光素鈉0.02ml/kg的劑量靜脈給藥即可獲得清晰的共聚焦顯微內(nèi)鏡圖像。2.靜脈應(yīng)用10%熒光素鈉0.02ml/kg后患者無(wú)肉眼可見(jiàn)的皮膚黃染,不影響日常生活及工作。第二部分小劑量熒光素鈉在胃腸上皮化生診斷中的作用1.小劑量熒光素鈉(10%0.02ml/kg)對(duì)胃黏膜腸上皮化生的診斷效能等同于傳統(tǒng)劑量熒光素鈉(10%0.1ml/kg)。研究意義：探頭式共聚焦顯微內(nèi)鏡(pCLE)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于胃腸道黏膜疾病的在體實(shí)時(shí)診斷,但由于常規(guī)劑量的熒光素鈉應(yīng)用后患者皮膚及尿液黃染明顯,對(duì)日常生活有一定影響,本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用小于常規(guī)劑量的熒光素鈉同樣可獲得清晰的共聚焦內(nèi)鏡圖像,同時(shí)無(wú)肉眼可見(jiàn)的皮膚黃染,更適合于共聚焦顯微內(nèi)鏡檢查,在腸化的診斷準(zhǔn)確性中等同于常規(guī)劑量的熒光素鈉。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R57

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1452903