本文關(guān)鍵詞：丙酮酸乙酯對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化保護作用的研究　出處：《成都醫(yī)學院》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：肝纖維化(liver fibrosis)是機體對各種刺激損傷修復的動態(tài)過程,是細胞外基質(zhì)(ECM)產(chǎn)生和降解失平衡所致細胞外基質(zhì)過度沉積的一種狀態(tài)�；|(zhì)金屬酶(MMPs)及其抑制劑(TIMPs)的平衡影響ECM的降解。作為肝臟纖維發(fā)生的主要效應細胞,肝星狀細胞(HSCs)與肝內(nèi)其他宿主細胞如肝細胞、肝巨噬細胞、內(nèi)皮細胞等相互作用促進纖維化的發(fā)生、發(fā)展。HSCs處于激活狀態(tài)以及維持存活需要一些信號調(diào)控。這些信號受多因子調(diào)控,既有來自HSCs自分泌,也有旁分泌。HSC中,TOLL樣受體4(TLR4)誘導炎癥趨化分子和粘附分子的表達,核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)通過各種刺激和細胞應激而激活,調(diào)控炎癥反應,因此他們在慢性肝病中發(fā)揮主要作用。丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate,EP)具有抗炎性能在各種損傷模型中發(fā)揮保護作用。目的通過皮下注射四氯化碳(CCl4)建立肝纖維化模型,觀察EP干預后不同時間點大鼠肝纖維化進展,以及肝臟星狀細胞激活標記物(α-SMA)、TLR4、NF-κB、MMPs及TIMPs和膠原纖維1、3、4的表達變化,初步探討EP抑制肝纖維化中星狀細胞激活以及加速膠原降解,從而逆轉(zhuǎn)肝纖維化的機理。方法健康成年SD大鼠,隨機分為三組:對照組(Control)、四氯化碳模型組(CCl4)、丙酮酸乙酯干預組(CCl4+EP)。采用皮下注射CCl4,每周兩次,共8周,制備纖維化模型;EP干預處理,每天一次;于2、4、6、8周四個時間點中最后一次注射CCl4的48h后,分別取大鼠肝臟樣本。統(tǒng)計第8w腹水狀況。HE、MASSON和ISHAK評分染色用于評定肝臟病理變化及纖維化程度。Q-PCR用于檢測TLR4、NF-κB、MMPs、TIMPs和膠原纖維1、3、4mRNA的表達變化,ELISA檢測肝組織中α-SMA、TLR4、MMP2、TIMP2、膠原蛋白4的含量變化;免疫組化用于檢測α-SMA、TLR4、NF-κB、MMPs、TIMPs和膠原纖維1、4陽性細胞的表達變化以及細胞定位。結(jié)果1.大鼠皮下注射CCl4后,每天進行腹腔注射(40mg/kg)的EP,在2、4、6、8周4個時間點EP注射后12h取材,EP明顯改善大鼠飲食和精神狀態(tài),體重相對于CCl4組有所增加,毛發(fā)光澤,皮膚損傷較小,且短期內(nèi)可愈合。EP處理后大鼠血清ALT、AST水平明顯下降,肝功能改善。2.CCl4注射后,肝組織病理變化明顯,肝細胞水腫、脂肪變、假小葉形成等肝組織結(jié)構(gòu)紊亂。EP干預后肝組織損傷明顯減輕,膠原纖維面積減少。3.CCl4誘導肝纖維化中,肝星狀細胞大量激活,EP干預后肝星狀細胞激活標記物α-SMA明顯減少。4.免疫組化結(jié)果顯示α-SMA,MyD88在竇周隙中陽性表達,TLR4、NF-κB、MMP2、MMP9,TIMP1、TIMP2在肝組織中陽性表達。5.Q-PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,α-SMA、TLR4、NF-κB、HMGB1、IL6、MMPs、TIMPs和膠原纖維1、3、4mRNA的表達顯著增加,應用EP后表達明顯減少(P0.05),MMPs/TIMPs比率上升。但2W時間點α-SMA、MMPs、TIMPs和膠原纖維1、3、4mRNA無統(tǒng)計學意義。6.ELISA結(jié)果顯示,α-SMA、TLR4、MMP2、TIMP2、膠原蛋白IV的含量與Q-PCR結(jié)果相一致。結(jié)論1、每天腹腔注射丙酮酸乙酯對CCl4引起的肝損傷具有保護作用。2、EP抑制CCl4所致的肝星狀細胞激活。3、EP可能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路,抑制HSCs激活、減輕炎癥反應從而發(fā)揮抗纖維化作用。4、EP上調(diào)MMPs/TIMPs比率加速膠原纖維降解有關(guān)。
[Abstract]:Hepatic fibrosis (liver fibrosis) is the body of various stimulating dynamic process of injury and repair of the extracellular matrix (ECM) is a state of imbalance and degradation caused by excessive deposition of extracellular matrix. The matrix metalloproteinases (MMPs) and its inhibitor (TIMPs) balance influence the degradation of ECM. The main effect as liver fiber the cells, hepatic stellate cells (HSCs) in the liver and other host cells such as hepatocytes, hepatic macrophages, endothelial cell interactions promote fibrosis, development of.HSCs is activated and the survival need some signal regulation. These signals is affected by many factors, both from HSCs have autocrine, paracrine.HSC, TOLL like receptor 4 (TLR4) expression induced by chemokines and adhesion molecules, nuclear transcription factor (NF- K B) is activated by various stimuli and cell stress, regulate inflammation, so they are chronic Play a major role in liver disease. Ethyl pyruvate (ethyl pyruvate EP) has anti-inflammatory properties in a variety of injury play a protective role in the model. By subcutaneous injection of carbon tetrachloride (CCl4) to establish the model of hepatic fibrosis, observe the effect of EP on liver fibrosis in rats at different time points in the exhibition, and hepatic stellate cell activation markers (alpha -SMA), TLR4, NF- K B, expression of MMPs and TIMPs and collagen 1,3,4, preliminary study on inhibition of EP activation of hepatic stellate cells in liver fibrosis and accelerate collagen degradation mechanism, thus reversing hepatic fibrosis. Methods healthy years SD rats were randomly divided into three groups: control group, CCl4 model group (Control) (CCl4), ethyl pyruvate intervention group (CCl4+EP). By subcutaneous injection of CCl4, two times a week, a total of 8 weeks, the preparation of EP fibrosis model; intervention treatment, once a day; at 2,4,6,8 Thursday at the time of the last injection of CCl4 48H After the rats were taken liver samples. The statistical 8W ascites condition.HE, is used to evaluate the pathological changes of liver fibrosis and.Q-PCR for the detection of TLR4 MASSON and ISHAK NF- staining score, kappa B, MMPs, expression of TIMPs and collagen 1,3,4mRNA, detection of ELISA in liver tissues of TLR4, alpha -SMA, MMP2, TIMP2, collagen 4 content; immunohistochemistry for the detection of alpha -SMA, TLR4, NF- kappa B, MMPs, expression of TIMPs and collagen fibers of 1,4 positive cells and cellular localization. Results 1. rats by subcutaneous injection of CCl4 after intraperitoneal injection every day (40mg/kg) of EP, 2,4,6,8 in the 4 week time point after EP injection 12h based EP, significantly improve the rat diet and mental state, body weight increased compared with CCl4 group, shiny hair, skin damage is small, and the short term serum ALT healing in rats after.EP treatment, the AST level decreased significantly after.2.CCl4 injection can improve the liver function, liver disease Physical changes obviously, liver cell edema, fatty degeneration, pseudolobule liver tissue injury significantly reduced liver tissue structure disorder after.EP intervention, collagen fiber area decreased.3.CCl4 induced liver fibrosis, a large number of activated hepatic stellate cells, EP after the intervention of hepatic stellate cell activation markers alpha -SMA significantly reduced.4. immunohistochemical results show a -SMA, MyD88 in the perisinusoidal space in the positive expression of TLR4, NF-, MMP2, MMP9, B, TIMP1, TIMP2 showed positive expression of.5.Q-PCR in liver tissue, compared with the control group, a -SMA, TLR4, HMGB1, NF- kappa B, IL6, MMPs, TIMPs and 1,3,4mRNA expression of collagen fibers significantly increased after application of EP expression was significantly reduced (P0.05), MMPs/TIMPs ratio increased. But the 2W time point alpha -SMA MMPs, TIMPs and collagen 1,3,4mRNA was not statistically significant.6.ELISA results showed that alpha -SMA, TLR4, MMP2, TIMP2, consistent with the results of Q-PCR content of collagen IV. Conclusion: 1, each Intraperitoneal liver injury caused by CCl4 injection of ethyl pyruvate on the protective effect of.2 and EP in hepatic stellate cells inhibits CCl4 induced activation of.3, EP may inhibit TLR4/NF- B signaling pathway, inhibiting the activation of HSCs, relieve the inflammation and anti fibrotic effect of.4 EP MMPs raised /TIMPs ratio accelerated degradation of collagen fibers.

【學位授予單位】：成都醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2

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