本文關(guān)鍵詞：HCV核心蛋白下調(diào)E-cadherin表達(dá)的分子機(jī)制研究　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:據(jù)統(tǒng)計(jì),原發(fā)性肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是目前全球范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。非酒精性脂肪肝病、肝炎病毒的慢性感染、過(guò)量攝入酒精、黃曲霉素以及自身免疫性肝病等都是引起HCC的重要原因,其中丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染是導(dǎo)致HCC發(fā)生的其中一個(gè)重要原因。根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),目前全球HCV感染率大約3%,并且每年因?yàn)镠CV感染導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生慢性炎癥、肝硬化,甚至是肝癌的患者數(shù)正以1%-7%的速度增加。因此,HCV慢性感染已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類健康的社會(huì)公共衛(wèi)生問(wèn)題。HCV病毒主要可以分為6種基因型,80多種亞型,其中我國(guó)多發(fā)為1b型和6型,研究表明,HCV 1b型感染患者的肝細(xì)胞損傷程度較其他基因型感染者更加嚴(yán)重,并且發(fā)展為肝硬化,甚至是肝癌的幾率更高。所以,開(kāi)展有關(guān)HCV感染引起HCC相關(guān)機(jī)制的研究具有極其重要的意義。1989年,Choo QL等首次鑒定出HCV病毒,它是除乙型、甲型肝炎病毒以外引起慢性肝炎的主要病原體。HCV屬于黃病毒科嗜肝病毒,為基因組全長(zhǎng)9.6kb的單股正鏈RNA病毒,在各種宿主細(xì)胞信號(hào)肽酶以及病毒蛋白酶的共同作用下,可以編碼成至少10種病毒蛋白,從氨基端到羧基端依次包括3種結(jié)構(gòu)蛋白(Core、E1、E2)以及P7、NS2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a和ns5b7種非結(jié)構(gòu)蛋白。其中hcv核心蛋白(hcvcore)在病毒與宿主細(xì)胞相互作用中扮演了非常重要的角色,具有直接的致癌效應(yīng),其誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控異常參與了hcv相關(guān)肝癌的發(fā)生和惡性轉(zhuǎn)移過(guò)程,但具體機(jī)制不明。snail是轉(zhuǎn)錄因子snail超家族的重要成員,研究表明snail是上皮細(xì)胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象中的關(guān)鍵誘導(dǎo)分子,對(duì)干細(xì)胞特性的維持、細(xì)胞生存和凋亡以及免疫調(diào)節(jié)起著重要作用。snail基因總共含有264個(gè)氨基酸,主要包含3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域,有證據(jù)表明,snail基因羧基端的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)可以特異性識(shí)別含有5’-caggtg-3’堿基序列的e-box結(jié)構(gòu),抑制基因的表達(dá),這一機(jī)制被認(rèn)為是snail抑制e-cadherin表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生emt轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵。1980年,人們首次發(fā)現(xiàn)一種具有絲氨酸/蘇氨酸活性的激酶—糖原合成酶激酶-3(glycogensynthasekinase-3,gsk-3),是參與調(diào)控糖原合成的關(guān)鍵酶之一。gsk-3家族分為α和β兩個(gè)亞型,其中g(shù)sk-3β是wnt/β-catenin和pi3k/akt信號(hào)通路的關(guān)鍵組成部分,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、分化、增殖與凋亡等過(guò)程,在腫瘤細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn),hepg2肝癌細(xì)胞株中的e-cadherin表達(dá)水平明顯下降,而胞漿內(nèi)p-gsk3β(gsk-3β失活)的水平卻顯著上升,說(shuō)明gsk-3β可能參與調(diào)控e-cadherin轉(zhuǎn)錄。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):(1)在hcv核心蛋白過(guò)表達(dá)的肝癌細(xì)胞和肝前體細(xì)胞、hcv感染的huh7.5.1細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng),通過(guò)對(duì)emt分子標(biāo)志物的檢測(cè)發(fā)現(xiàn):hcv核心蛋白下調(diào)e-cadherin表達(dá),上調(diào)vimentin表達(dá),并且外源表達(dá)e-cadherin可以部分逆轉(zhuǎn)core誘導(dǎo)的emt;(2)hcvcore抑制e-cadherin啟動(dòng)子活性,并與snail的結(jié)合位點(diǎn)e-box密切相關(guān);(3)信號(hào)通路報(bào)告質(zhì)粒篩查實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),過(guò)表達(dá)hcvcore的肝癌細(xì)胞pi3k/akt信號(hào)通路活化,p-akt和p-gsk3β的表達(dá)水平上調(diào),gsk-3β活性受到抑制。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)core對(duì)e-cadherin的調(diào)控與snail作用于e-cadherin的位點(diǎn)相關(guān),因此我們猜想hcvcore有無(wú)可能直接與轉(zhuǎn)錄因子snail作用,負(fù)性調(diào)控e-cadherin表達(dá),并對(duì)兩者的相互作用進(jìn)行了比較深入的分析;同時(shí)考慮到snail蛋白容易降解,且與gsk-3β活性相關(guān),我們推測(cè)hcvcore是否可能直接抑制gsk-3β活性,減少其對(duì)轉(zhuǎn)錄因子snail的降解,促進(jìn)snail的穩(wěn)定性,進(jìn)而調(diào)控e-cadherin的表達(dá)?本課題將對(duì)深入了解hcv參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、emt進(jìn)程以及肝癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制具有重要的意義,同時(shí)也為開(kāi)發(fā)hcv治療藥物靶標(biāo)奠定分子基礎(chǔ)。方法:本研究擬通過(guò)hcvcore過(guò)表達(dá)細(xì)胞模型以及hcv體外細(xì)胞復(fù)制模型,采用transwell、westernblot、sirna技術(shù)觀察hcvcore對(duì)e-cadherin表達(dá)的影響;并進(jìn)一步通過(guò)染色質(zhì)免疫共沉淀(chromatinimmunoprecipitation,chip)、免疫共沉淀(immunoprecipitation,ip)、gst-pulldown、免疫熒光(immunofluorescence,if)等實(shí)驗(yàn)技術(shù),深入探索hcv核心蛋白與snail作用于e-cadherin表達(dá)的相關(guān)性,在轉(zhuǎn)錄水平深入分析core能否與snail或其他組蛋白修飾酶形成復(fù)合物,共同調(diào)控e-cadherin的表達(dá);同時(shí)還將研究hcvcore能否促進(jìn)gsk-3β的轉(zhuǎn)位,下調(diào)gsk-3β活性,參與細(xì)胞emt進(jìn)程。結(jié)果:采用wakita的實(shí)驗(yàn)方案,我們成功轉(zhuǎn)錄獲得了jfh-1rna,將其轉(zhuǎn)染huh7.5.1細(xì)胞后,檢測(cè)到了hcvcore的穩(wěn)定表達(dá);收集轉(zhuǎn)染后第3天的細(xì)胞上清,經(jīng)濃縮、過(guò)濾后感染hlcz01細(xì)胞8天,檢測(cè)到細(xì)胞內(nèi)hcvrna含量明顯上升,同時(shí)免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察到core蛋白的表達(dá)。在過(guò)表達(dá)hcv核心蛋白的的sk-hep1細(xì)胞中,我們發(fā)現(xiàn)hcvcore明顯增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力,而外源性回復(fù)e-cadherin表達(dá)后,細(xì)胞的emt轉(zhuǎn)化過(guò)程部分受到阻斷;在過(guò)表達(dá)核心蛋白的huh7細(xì)胞中,沉默內(nèi)源性e-cadheirn表達(dá)后,細(xì)胞的遷移、侵襲能力進(jìn)一步增強(qiáng)。同時(shí)我們?cè)趈fh-1轉(zhuǎn)染的huh7.5.1細(xì)胞模型以及jfh-1感染的hlcz01細(xì)胞模型中,觀察到hcvcore能夠明顯下調(diào)e-cadherin表達(dá)。在轉(zhuǎn)染jfh-1rna的huh7.5.1細(xì)胞中,通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)core蛋白可定位于細(xì)胞核內(nèi),且與轉(zhuǎn)錄因子snail存在共定位現(xiàn)象;同時(shí)采用免疫共沉淀、gst-pulldown等實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)hcvcore主要與snail基因羧基端相結(jié)合,從而發(fā)揮對(duì)e-cadherin基因的負(fù)性調(diào)控作用。同時(shí)snail可以招募hdacs增強(qiáng)core結(jié)合于cdh1啟動(dòng)子區(qū),形成復(fù)合物,共同調(diào)控e-cadherin表達(dá)。另外,在轉(zhuǎn)染jfh-1rna的huh7.5.1細(xì)胞中,我們發(fā)現(xiàn)hcvcore能夠促進(jìn)gsk-3β的轉(zhuǎn)位,促進(jìn)其磷酸化,從而下調(diào)gsk-3β酶的活性,實(shí)現(xiàn)細(xì)胞emt轉(zhuǎn)變過(guò)程。結(jié)論:我們發(fā)現(xiàn)hcv核心蛋白可以促進(jìn)gsk-3β的轉(zhuǎn)位,下調(diào)其酶活性;通過(guò)chip、ip實(shí)驗(yàn)證實(shí)hcvcore與snailc-端153-264位氨基酸編碼蛋白結(jié)合,募集HDACs形成抑制性復(fù)合物,共同抑制E-cadherin表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞EMT進(jìn)程。揭示了HCV core對(duì)肝癌發(fā)生、發(fā)展的促進(jìn)作用與轉(zhuǎn)錄因子Snail密切相關(guān),為闡明HCV感染導(dǎo)致的相關(guān)肝癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的理論依據(jù),同時(shí)也為HCV感染而導(dǎo)致的肝癌的靶向治療奠定了極其重要的理論基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7;R512.63

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉寧;馮悅;張阿梅;岳蕾;夏雪山;;HCV復(fù)制子與細(xì)胞培養(yǎng)體系研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2014年08期

2 張阿麗,王全勝,鐘亞華,陳剛,奚玲,謝從華,周云峰,馬丁;轉(zhuǎn)錄因子Snail調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)型及對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的逆轉(zhuǎn)作用[J];癌癥;2005年11期

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本文編號(hào)：1371506