本文關鍵詞：戊型肝炎病毒感染引起腎臟和睪丸損傷的病理學研究　出處：《中國農(nóng)業(yè)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：為了揭示戊型肝炎病毒(HEV)對動物肝外組織的感染損傷作用,本研究應用已建立的豬源HEV感染蒙古沙鼠模型和HEV感染兔模型,用豬HEV懸液腹腔注射感染沙鼠和兔試驗,采用RT-PCR,免疫組化和Western bloting等方法,系統(tǒng)觀察了豬源HEV感染沙鼠的腎臟及睪丸組織中的HEV病毒載量及HEV-ORF2和HEV-ORF3抗原的在上述器官中的表達、分布的動態(tài)變化,同時觀察研究了HEV對感染沙鼠及兔的腎和睪丸組織的組織病理學和超微病理學變化,并采用細胞化學和免疫組化等方法初步觀察了HEV感染沙鼠腎臟和睪丸組織中線粒體凋亡相關蛋白及腎臟中內(nèi)質網(wǎng)應激相關蛋白表達的變化,初步揭示了HEV感染引起腎臟和睪丸損傷的機制。研究結果如下。1.沙鼠腎臟的觀察結果實時定量PCR結果顯示,在接種病毒7天后,腎臟中檢測到HEV RNA。通過HEV ORF2抗原的免疫組化和HEV ORF3蛋白的蛋白印跡技術檢測結果均顯示,病毒的復制在接種14天時達到峰值(7.18 logs g-1)。組織病理學觀察結果發(fā)現(xiàn),腎臟的病變包括腎小球萎縮、變性、水腫,腎小管上皮細胞壞死。三色和天狼猩紅染色表明感染沙鼠腎組織中有膠原纖維增生現(xiàn)象。電鏡觀察結果顯示,腎小管基底膜粗糙不平,上皮細胞線粒體腫脹、空泡化。試驗組TUNEL染色陽性細胞數(shù)量明顯高于對照組(P0.01)免疫組織化學觀察結果表明,在HEV感染沙鼠后的各個時間點,腎臟組織中細胞凋亡相關蛋白Bax、Bax與Bcl-2的比值、Fas和Caspase-3蛋白的表達量都顯著增加。同時,腎臟組織中的內(nèi)質網(wǎng)應激相關蛋白HSP70、GRP78、CHOP和Caspase-12的表達量均顯著增加。與上述免疫組化觀察相應的指標實時熒光定量PCR結果顯示在HEV接種組沙鼠腎組織中的Bax、Bcl-2、Caspase-3和GRP78,CHOP,JNK和caspase-12的mRNA轉錄水平顯著增高(P0.05或P0.01)、Western blotting的檢測結果也表明上述各項檢測指標也均明顯增高。上述結果表明,HEV感染沙鼠腎臟組織中線粒體凋亡途徑及內(nèi)質網(wǎng)應激反應均被激活,這可能是HEV感染引起腎臟損傷的機制所在。2.沙鼠睪丸的觀察結果豬源HEV腹腔接種沙鼠后14天時,PCR檢測結果在睪丸內(nèi)檢測到了HEV RNA。定量PCR檢測結果表明,在28天和42天時,病毒載量達到峰值,為3.12 logs g-1 to 6.23 logs g-1。通過免疫組化和Western blot檢測HEV ORF3抗原在睪丸組織生精細胞中均有表達。組織病理學及超微病理學觀察發(fā)現(xiàn),感染沙鼠的睪丸組織均有不同程度的病理損傷。臨床血液生化檢測結果表明HEV感染沙鼠的血清睪酮水平顯著下降,而血尿素氮(BUN)顯著增加。試驗組睪丸組織TUNEL染色陽性細胞數(shù)量明顯高于對照組(P0.01)。免疫組織化學觀察結果表明,在HEV感染后的各個時間點,沙鼠睪丸組織中Fas-L、Fas、caspase-3、Bcl-2與Bax蛋白的表達量均顯著增加。與上述免疫組化觀察相應的指標實時熒光定量PCR結果顯示,在HEV接種組沙鼠睪丸組織中的Fas-L、Fas、Bax、Bcl-2和Caspase-3的mRNA轉錄水平也顯著增高(P0.05或P0.01)。Western blotting的檢測結果也表明上述各項檢測指標也均明顯增高(P0.05或P0.01)。此觀察結果表明,豬源HEV可在感染沙鼠睪丸組織中均可檢出HEV RNA和HEVORF2及ORF3抗原,而且HEV可在睪丸組織細胞中復制表達,并引起睪丸組織的病理損傷。感染可引起感染沙鼠睪丸組織中線粒體凋亡通路的活化,促進感染沙鼠睪丸組織細胞的細胞凋亡進程。3.家兔腎臟的觀察結果兔源HEV腹腔感染家兔后,PCR、免疫組化和Western bloting的檢測結果在感染的第二周兔的腎臟組織中均檢測到了HEV RNA和ORF2抗原的存在。組織病理學觀察可見感染兔的腎臟有明顯的病理損傷,表現(xiàn)為腎小球萎縮,腎球囊擴張、腎小管上皮細胞普遍變性、壞死,各例均見腎小管管腔中有蛋白質管型；各例腎間質均見水腫、出血、淋巴細胞浸潤和局灶性纖維組織增生。在HEV感染兔子期間,血清中AST、ALT及TBIL均明顯增加(P0.05,P0.01)。TUNEL染色結果顯示,在感染后7d至42d,TUNEL染色陽性細胞數(shù)量明顯高于對照組(P0.05,P0.01)。此觀察結果表明,豬源HEV可在感染家兔的睪丸組織細胞中復制表達,并引起睪丸組織的病理損傷。感染可促進感染兔睪丸組織中細胞凋亡綜上所述,豬源HEV可在感染沙鼠的肝外器官腎和睪丸及家兔的腎臟組織中均可檢出HEV RNA和HEV ORF2及ORF3抗原,而且HEV可在腎和睪丸的組織細胞中復制表達,并且可引起腎和睪丸組織的明顯損傷。HEV感染可引起感染沙鼠的腎臟的腎小管上皮和睪丸生精小管上皮細胞線粒體結構的明顯損傷,并且可激活感染細胞線粒體的凋亡途徑,促進腎臟和睪丸的細胞凋亡。
【學位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R512.6;R-332
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本文編號：1325603