本文關(guān)鍵詞：乙肝相關(guān)肝細胞癌患者術(shù)后病毒激活及其與TLR9關(guān)系的研究　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：肝細胞肝癌是全球發(fā)病率排前十、致死率排第二的惡性腫瘤。在我國,60%肝癌患者是由慢性乙型肝炎發(fā)展而來,稱為乙肝相關(guān)肝細胞癌。乙肝相關(guān)肝細胞癌患者體內(nèi)存在兩種狀態(tài),即惡性腫瘤狀態(tài)和乙型肝炎病毒感染狀態(tài)。針對肝細胞癌,目前公認的治療措施有肝切除、肝移植、肝動脈化療栓塞和局部消融等。乙肝相關(guān)肝細胞癌患者在接受抗腫瘤治療過程中會出現(xiàn)病毒激活,病毒激活引起的機體免疫損傷會加重肝臟的炎癥反應(yīng),加快肝硬化進程,進而使患者失去抗腫瘤治療的肝功能基礎(chǔ),甚至使治療中斷,最終影響患者的預(yù)后。Toll樣受體9(TLR9)是一類介導(dǎo)天然免疫反應(yīng)的跨膜信號傳遞受體,是模式識別受體家族中的一員,高表達于漿細胞樣樹突狀細胞和B細胞上,弱表達于肝細胞、枯否細胞、間質(zhì)細胞和腫瘤細胞表面。乙型肝炎病毒是一種嗜肝性、非致細胞病變的DNA病毒,主要與漿細胞樣樹突狀細胞表面的TLR9結(jié)合,激活依賴髓樣分化因子(MyD88)信號通路,啟動機體免疫反應(yīng)。已有研究證實樹突狀細胞及TLR9信號通路分子障礙會引起病毒持續(xù)性感染,同時激活TLR9信號通路相關(guān)分子可以在一定程度上抑制病毒復(fù)制。但目前關(guān)于TLR9在病毒激活中的作用尚無相關(guān)報道。因此分析乙肝相關(guān)肝細胞癌患者術(shù)后病毒激活的危險因素,并深入探討TLR9與病毒激活的關(guān)系,能夠為尋找抗病毒激活治療新靶點提供理論依據(jù)。本課題是以乙肝相關(guān)肝細胞癌患者為對象開展的臨床與基礎(chǔ)相結(jié)合的研究,共納入了2015年3月至2015年12月于我科行手術(shù)治療的34例乙肝相關(guān)肝細胞癌患者。第一部分收集患者臨床資料,并進行隨訪,分析乙肝相關(guān)肝細胞癌患者術(shù)后病毒激活的臨床危險因素;第二部分收集了患者術(shù)前和術(shù)后外周血,分離漿細胞樣樹突狀細胞和外周血血漿,探討TLR9信號通路分子(TLR9、MyD88、IRAK1、TRAF6、TAK1、IRF7)mRNA表達水平、細胞因子(IFN-α、IL-6、IL-12、TNF-α)分泌量與病毒激活的關(guān)系;第三部分收集了入組患者手術(shù)切除標本(腫瘤組織和癌旁組織),研究組織中TLR9分子是否也參與了病毒激活過程,并探討其發(fā)揮作用的下游分子。第一部分:收集患者臨床數(shù)據(jù),如人口學(xué)信息(性別、年齡)、肝炎背景、血常規(guī)(白細胞計數(shù)、血小板計數(shù))、肝功能(總膽紅素、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、白蛋白、前白蛋白)、腎功能(肌酐、尿素氮)、腫瘤指標(甲胎蛋白)、乙肝兩對半、術(shù)前術(shù)后HBV DNA載量以及一些其他相關(guān)指標如腫瘤部位、腫瘤大小、癌栓、子灶、術(shù)中肝門阻斷時間、出血量等。術(shù)后隨訪患者HBV DNA載量及臨床指標變化,后按病毒激活標準將患者分為激活組和未激活組。其中激活組10例,未激活組24例。采用SPSS 20.0(Chicago,IL,United States)軟件對乙肝相關(guān)肝細胞癌患者術(shù)后病毒激活進行單因素和多因素非條件logistic回歸分析。單因素分析提示:1)術(shù)前丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶明顯升高者(100u/l)術(shù)后病毒激活發(fā)生率顯著高于術(shù)前轉(zhuǎn)氨酶正常者(100.0%vs20.0%,p=0.001)。2)術(shù)前長期行抗病毒治療的患者術(shù)后病毒激活發(fā)生率明顯低于未行抗病毒治療者(56.3%vs5.6%,p=0.001)。3)術(shù)后第七天天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶仍然較高者(100u/l)病毒激活率顯著高于術(shù)后轉(zhuǎn)氨酶正常者(66.7%vs21.4%,p=0.027)。多因素logistic回歸分析提示:術(shù)前未長期行抗病毒治療是乙肝相關(guān)肝細胞癌患者術(shù)后病毒激活的獨立危險因素(hr=13.908;95%ci,1.137—170.067,p=0.039)。第二部分:為進一步從免疫學(xué)和分子生物學(xué)基礎(chǔ)上分析乙肝相關(guān)肝細胞癌患者術(shù)后病毒激活機制,本課題收集了患者術(shù)前和術(shù)后第七天的外周血,分離漿細胞樣樹突狀細胞,定量檢測tlr9信號通路分子(tlr9、myd88、irak1、traf6、tak1、irf7)mrna表達水平,并采用酶聯(lián)免疫試劑盒(elisa)檢測血漿中細胞因子(ifn-α、il-6、il-12、tnf-α)含量。最后采用統(tǒng)計學(xué)方法比較兩組患者術(shù)前術(shù)后上述分子及細胞因子表達差異。結(jié)果提示:1)病毒激活與患者術(shù)前和術(shù)后外周血中樹突狀細胞數(shù)目無明顯相關(guān)性。2)激活組患者術(shù)前和術(shù)后tlr9信號通路相關(guān)分子(tlr9、myd88、irak1、traf6、tak1、irf7)mrna相對表達水平均較未激活組減少。統(tǒng)計學(xué)分析提示:激活組術(shù)前myd88mrna含量較未激活組減少(0.39,0.26-2.59vs1.03,0.64-2.62,p=0.042);激活組術(shù)前irf7mrna相對表達量為(0.67,0.28-1.00),未激活組為(2.42,1.19-5.46)(p=0.008);激活組術(shù)后tlr9mrna相對表達量為(0.27,0.12-0.32)較未激活組(0.63,0.28-1.09)明顯減少(p=0.009);術(shù)后traf6mrna相對表達量為(0.69,0.49-0.98)顯著低于未激活組(1.02,0.80-1.79)(p=0.025);術(shù)后tak1mrna激活組相對表達量為(0.22,0.14-0.62)低于未激活組為(0.54,0.29-1.04)(p=0.038);術(shù)后irf7mrna激活組表達量為(0.26,0.18-0.52)較未激活組(0.66,0.32-1.02)明顯減少(p=0.020)。3)elisa檢測提示激活組患者術(shù)后外周血漿中腫瘤壞死因子(tnf-α)分泌量較未激活組顯著減少(11.44±2.04pg/mlvs14.78±3.55pg/ml,p=0.002)。第三部分:收集患者術(shù)中腫瘤組織和癌旁組織,抽提rna和蛋白,通過定量pcr、免疫組化和蛋白免疫印跡等方法分析tlr9、myd88、irak1、traf6、tak1、irf7分子表達差異與病毒激活的關(guān)系。結(jié)果顯示:1)激活組和未激活組患者腫瘤組織中上述分子mrna表達水平無明顯差異。2)激活組患者癌旁組織中tlr9mrna表達較未激活組明顯增多(6.35,4.43-14.17vs0.66,0.28-1.64,p=0.006),且蛋白免疫印跡提示tlr9蛋白水平表達也較未激活組顯著增多。但激活組和未激活組癌旁組織中myd88、irak1、traf6、tak1、irf7分子轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平表達無明顯差異。本課題可以得出以下結(jié)論:1)術(shù)前未長期行抗病毒治療是乙肝相關(guān)肝細胞癌患者術(shù)后病毒激活的獨立危險因素,提示臨床上積極抗病毒治療可能可以降低術(shù)后病毒激活發(fā)生率。2)病毒激活與漿細胞樣樹突狀細胞數(shù)目無關(guān),提示其可能與細胞功能障礙有關(guān)。3)激活組患者TLR9在外周血漿細胞樣樹突狀細胞上呈低表達而在癌旁組織中高表達,提示TLR9在乙肝相關(guān)肝細胞患者術(shù)后病毒激活中可能起著“雙刃劍”作用:樹突狀細胞等免疫細胞上表達的TLR9可以調(diào)節(jié)機體固有免疫及適應(yīng)性免疫,促進細胞因子的釋放;癌旁組織上表達的TLR9能夠幫助乙肝病毒逃避宿主監(jiān)視,躲避術(shù)前病毒清除從而引起病毒激活。4)乙肝相關(guān)肝細胞癌患者術(shù)后TNF-α分泌減少可能是病毒激活的機制之一。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.62;R735.7

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本文編號：1317034