本文關(guān)鍵詞：補體在潰瘍性結(jié)腸炎癌變中的作用及機制研究　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：補體是免疫系統(tǒng)重要的組成部分,在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和抗感染免疫等方面發(fā)揮著十分重要的作用。在生理情況下,補體成分是以無活性的酶前體形式存在的,在某些啟動因素影響下可被依次活化產(chǎn)生級聯(lián)放大效應(yīng)而發(fā)揮作用。目前,有關(guān)補體與腸炎、腫瘤關(guān)系的研究較多,在與腸炎關(guān)系的研究中發(fā)現(xiàn),補體存在時炎癥會加重,而補體缺失炎癥則會減輕,這證實補體能促進(jìn)腸炎的發(fā)展;但在與腫瘤關(guān)系的研究中,情況卻較為復(fù)雜,部分實驗結(jié)果證實補體能抑制腫瘤的生長,而另一些實驗結(jié)果則發(fā)現(xiàn)補體能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)是一種病因不明、病程周期長的慢性腸道炎癥性疾病,由于缺乏有效治療,病情常遷延不愈。潰瘍性結(jié)腸炎最嚴(yán)重的并發(fā)癥是腸炎相關(guān)性結(jié)直腸癌(Colitis-associated colorectal cancer,CAC),隨著患病時間的延長,潰瘍性結(jié)腸炎癌變的幾率逐步增高,據(jù)統(tǒng)計,約有15%患者死于癌變。補體與腸炎、腸道腫瘤的發(fā)生均相關(guān),但在腸炎向腸癌轉(zhuǎn)變過程中的作用,目前國內(nèi)外卻鮮有報道。在這一過程中,補體是否起作用、起著什么樣的作用、作用的機制如何,均是值得探討的問題。目的 探討補體在UC癌變中的作用及機制,為將來可能的臨床應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。方法 1.以氧化偶氮甲烷(azoxymethane, AOM)和葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium, DSS)聯(lián)用的方法建立CAC小鼠模型：AOM單次腹腔注射,劑量為10mg/kg/只；5天后予以DSS溶液口服,濃度為1.5%,連服7天,然后換服清水14天,總計21天為一個周期,共三周期。單用DSS建立急性腸炎小鼠模型：予以DSS溶液口服,濃度3%,連服5天,然后換服清水5天。2.分別在建模的第0天、20天、40天、60天和第100天檢測小鼠補體活化的指標(biāo)：用定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitativepolymerase chain reaction,qPCR)檢測小鼠腸道勻漿中C3、C5、C3aR、C5aR的mRNA表達(dá)水平；用酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)檢測小鼠腸培養(yǎng)上清C3a、C5a的表達(dá)水平；用免疫組化的方法檢測小鼠腸道補體的水平。3.觀察活化補體在小鼠CAC模型中的作用：用腸道腫瘤計數(shù)及病理細(xì)胞學(xué)方法對比觀察補體缺失小鼠CAC模型(C3、C5、C5aR敲除)和野生型小鼠成瘤率的差異。4.明確補體在UC癌變中的作用機制：用病理細(xì)胞學(xué)、免疫組化及熒光激活細(xì)胞分選系統(tǒng)(Fluorescence activated cell sorting, FACS)檢測腸道細(xì)胞浸潤情況,同時檢測急性腸炎模型的腸道通透性和菌群移位情況,明確浸潤細(xì)胞與腸道通透性、腸道菌群移位的關(guān)系；qPCR、ELISA檢測腸道浸潤的細(xì)胞群所表達(dá)的細(xì)胞因子,同時通過體內(nèi)外實驗明確細(xì)胞群之間、細(xì)胞因子之間的關(guān)系以及它們與補體的關(guān)系；用免疫組化及western blotting檢測CAC模型腸道上皮增殖、凋亡情況及相關(guān)的信號通路,并明確它們和細(xì)胞因子之間的關(guān)系。結(jié)果1.無論是在急性模型還是在慢性模型的建模過程中,小鼠均出現(xiàn)了腹瀉、便血、體重下降等腸炎癥狀,建模結(jié)束后的腸道病理顯示：急性腸炎小鼠腸道明顯充血、水腫,腸上皮可見糜爛、潰瘍病灶,并有大量的炎性細(xì)胞浸潤；CAC模型小鼠除上述改變外,還可見腸道有多個結(jié)節(jié)狀腫瘤,鏡下觀察細(xì)胞異型增生明顯,核漿比失調(diào),腺管排列紊亂,腸上皮正常組織結(jié)構(gòu)被破壞,提示建模成功。2.與對照組相比,模型小鼠從建模20天起就出現(xiàn)了補體C3、C5、C3aR、 C5aR及補體活化產(chǎn)物C3a、C5a的表達(dá)升高,在建模40天、60天及100天時,上述指標(biāo)逐步升高。僅C5a的表達(dá)水平在20天、40天時升高,其后降低,這是因為當(dāng)C5a過度表達(dá)時,會和細(xì)胞膜表面的C5aR結(jié)合而被轉(zhuǎn)入到細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)致其胞外濃度減低,即C5a的內(nèi)化作用。這些結(jié)果顯示,在UC癌變的過程中,補體是持續(xù)活化的,且活化水平逐步增高。3.與野生型小鼠相比,無論是補體C3、C5還是C5aR缺失的小鼠,其成瘤率都明顯減低,提示在UC癌變過程中,補體不僅持續(xù)活化,且活化的補體發(fā)揮了促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的作用。4.與野生型CAC小鼠相比,補體缺失小鼠CAC模型中的腸道白細(xì)胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素17A(Interleukin-17 A,IL-17A)和白細(xì)胞介素22(Interleukin-22,IL-22)水平顯著降低,而一些常見的與腸炎、腸癌發(fā)展關(guān)系密切的因子如白細(xì)胞介素6(Interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子a(Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)、干擾素γ(Interferon gamma,IFNγ)等卻沒有明顯的變化,提示在UC癌變的過程中,活化補體主要是通過調(diào)節(jié)IL-1β、IL-17A和IL-22的表達(dá)水平而影響了腫瘤的發(fā)生。同時,補體缺失的小鼠模型腸道中的中性粒細(xì)胞浸潤顯著減少；在通常情況下,中性粒細(xì)胞聚集的最大誘因是細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物,而在腸道中存在著大量的菌群,那中性粒細(xì)胞的聚集是否和這些菌群相關(guān)呢?由于正常腸道粘膜有屏障作用,菌群不能進(jìn)入腸上皮層中,補體是否通過影響腸道通透性進(jìn)而導(dǎo)致腸道菌群移位而引起了中性粒細(xì)胞的聚集呢?通過檢測急性腸炎模型發(fā)現(xiàn),與正常小鼠相比,無論補體缺失與否,急性腸炎模型的腸道通透性都是明顯增加的,腸道菌群移位也是存在的,但補體缺失的急性腸炎模型和野生型急性腸炎模型相比,腸道通透性和腸道菌群移位卻沒有差異,提示補體不是通過這條途徑引起中性粒細(xì)胞浸潤的。進(jìn)一步的檢測發(fā)現(xiàn),中性粒細(xì)胞表達(dá)C5aR,可與C5a相結(jié)合,而C5a的趨化作用及免疫調(diào)節(jié)作用均是過敏毒素中最強的,說明活化補體是通過C5a引起了中性粒細(xì)胞在腸道的聚集。腸上皮qPCR、ELISA的結(jié)果顯示,IL-1β主要是由腸道中性粒細(xì)胞表達(dá)的,而當(dāng)補體缺失時不僅浸潤的中性粒細(xì)胞數(shù)量明顯減少,其表達(dá)IL-1β的能力也明顯下降；IL-17A則主要是由腸道CDllb+的髓系細(xì)胞表達(dá)的,當(dāng)補體缺失時,這群細(xì)胞的數(shù)量也是明顯減低的,表達(dá)IL-17A的能力也明顯減弱。體外實驗發(fā)現(xiàn),用IL-1β刺激髓系細(xì)胞,能上調(diào)IL-17A的表達(dá),而阻斷了IL-1β的作用后,IL-17A的表達(dá)下降；將不同來源的中性粒細(xì)胞與髓系細(xì)胞共孵育,發(fā)現(xiàn)野生型CAC模型鼠的中性粒細(xì)胞能明顯促進(jìn)髓系細(xì)胞上調(diào)IL-17A的表達(dá),而補體缺失CAC模型鼠中性粒細(xì)胞的刺激效果較差；體內(nèi)試驗中,分別在CAC模型中敲低[用白細(xì)胞介素-1受體拮抗劑(Interleuekin-1 receptor antagonist, IL-1Ra)模擬敲低的效果]和過表達(dá)IL-1p來檢測IL-17A的表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),敲低了IL-1β后,IL-17A的表達(dá)水平明顯減低,而過表達(dá)IL-1β后,IL-17A的水平明顯升高。這些結(jié)果都提示：在UC癌變過程中,IL-1β調(diào)節(jié)了IL-17A的表達(dá),結(jié)合前面的實驗結(jié)果,說明活化補體能通過中性粒細(xì)胞分泌IL-1β來調(diào)節(jié)髓系細(xì)胞表達(dá)IL-17A的水平,即存在著IL-1β/IL-17A調(diào)節(jié)軸。用IL-17A刺激腸腫瘤細(xì)胞系CT26,發(fā)現(xiàn)它能促進(jìn)細(xì)胞增殖,且其作用與IL-17A濃度呈正相關(guān)。免疫組化及western blotting的結(jié)果顯示：當(dāng)補體缺失時,腸上皮信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,stat3)和核轉(zhuǎn)錄因子κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)p65磷酸化水平明顯減低,進(jìn)而引起CAC模型鼠腸道上皮凋亡增加,增殖減弱,提示補體最終是通過這兩個信號通路導(dǎo)致了UC的癌變。結(jié)論 活化補體促進(jìn)了UC癌變,其機制是：活化的補體通過活化產(chǎn)物如C5a引起了腸道上皮中性粒細(xì)胞聚集并大量分泌IL-1p,IL-1p刺激腸道上皮浸潤的髓系細(xì)胞上調(diào)1 L-17A的表達(dá),進(jìn)而激活stat3和NF-κB p65信號磷酸化水平導(dǎo)致了腸癌的發(fā)生和發(fā)展。即活化補體通過腸道IL-1β/IL-17A調(diào)節(jié)軸促進(jìn)了Uc癌變。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R574.62;R735.3

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