本文關(guān)鍵詞：線粒體自噬在肝纖維化中的作用　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：肝纖維化(Liver fibrosis)是多種肝臟疾病共同的病理過程,其中一部分會進(jìn)展為肝硬化和/或肝癌,死亡率高,預(yù)后差,嚴(yán)重威脅人類健康。肝纖維化是一種可逆性的損傷-修復(fù)過程,細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)過度沉積是促進(jìn)肝纖維化進(jìn)展的重要因素,而細(xì)胞外基質(zhì)主要來源于肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs),因此抑制HSCs的活化是逆轉(zhuǎn)肝纖維化的關(guān)鍵。線粒體是生產(chǎn)能量的主要場所,參與多種細(xì)胞生命活動,因此,線粒體穩(wěn)態(tài)對維持正常的細(xì)胞功能至關(guān)重要。線粒體自噬(mitophagy)由Lemasters于2005年首次提出,主要指通過自噬的方式降解細(xì)胞內(nèi)損傷或多余的線粒體,維持線粒體數(shù)量及質(zhì)量的穩(wěn)定,從而維持正常的細(xì)胞功能。研究顯示,白藜蘆醇可誘導(dǎo)HSCs發(fā)生線粒體自噬,表明HSCs中存在線粒體自噬現(xiàn)象。但線粒體自噬與肝纖維化之間的關(guān)系,目前尚無報道。本研究擬以C57BL/6雄性小鼠及人HSCs細(xì)胞株LX-2為研究對象,建立肝纖維化模型,從動物及細(xì)胞層面進(jìn)行研究,探討線粒體自噬在肝纖維化中的作用。目的:探討線粒體自噬在肝纖維化中的作用,為肝纖維化的治療提供新思路。方法:本實驗通過腹腔注射CCl4建立小鼠肝纖維化模型并用TGF-β刺激LX-2細(xì)胞活化,分別在體內(nèi)及體外觀察肝纖維化形成及HSCs活化過程中線粒體自噬的變化。應(yīng)用線粒體自噬抑制劑Cyclosporine A及誘導(dǎo)劑Valinomycin驗證線粒體自噬與肝纖維化及HSCs活化之間的關(guān)系。通過檢測血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Alanine aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(Aspartate transaminase,AST)的水平及肝臟組織HE染色來觀察肝臟炎癥程度;通過天狼星紅染色觀察膠原變化,通過免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)分析α-SMA的表達(dá)。用蛋白免疫印跡法(Westen blotting,WB)分析α-SMA、Collagen I、HSP60、TOM20、PINK1蛋白的表達(dá)。結(jié)果:1肝纖維化及HSCs活化過程中線粒體自噬受到抑制腹腔注射橄欖油(oil)后6 W及注射CCl4后2 W、4 W和6 W,分別留取小鼠血清及肝臟組織,并進(jìn)行HE、天狼猩紅及IHC染色。結(jié)果顯示與oil組相比,CCl4組血清ALT及AST水平隨時間延長逐漸升高;HE染色顯示CCl4組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,炎細(xì)胞浸潤,肝細(xì)胞脂肪變性及壞死嚴(yán)重,6 W時達(dá)到高峰;天狼星紅染色及WB顯示CCl4組膠原纖維隨注射時間延長而增加,6 W時達(dá)到高峰;IHC及WB顯示CCl4組α-SMA表達(dá)隨用藥時間延長增加;上述結(jié)果證實肝纖維化造模成功。WB顯示在CCl4組中,代表線粒體剩余量的TOM20及HSP60表達(dá)顯著增加,表明肝纖維化過程中線粒體自噬被抑制。在細(xì)胞實驗中應(yīng)用不同濃度梯度及時間梯度的TGF-β刺激HSCs活化,WB結(jié)果顯示HSCs活化指標(biāo)α-SMA及Collagen I表達(dá)增加,線粒體剩余量指標(biāo)TOM20、HSP60表達(dá)增加,線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1表達(dá)減少,并且各指標(biāo)變化呈濃度依賴性及時間依賴性,表明HSCs活化過程中,線粒體自噬減弱。2抑制線粒體自噬促進(jìn)肝纖維化及HSCs活化動物實驗中,與單獨應(yīng)用CCl4組相比,應(yīng)用線粒體自噬抑制劑CsA后,小鼠肝臟TOM20及HSP60的表達(dá)增加,證明CsA能夠抑制線粒體自噬。應(yīng)用CsA后,與單獨應(yīng)用CCl4組相比,小鼠血清ALT、AST水平更高,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂程度、炎細(xì)胞浸潤、肝細(xì)胞脂肪變及壞死程度更重,膠原沉積更加明顯、α-SMA表達(dá)進(jìn)一步上調(diào),表明線粒體自噬抑制劑CsA可促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程。細(xì)胞實驗中,與單純TGF-β刺激組比較,應(yīng)用線粒體自噬抑制劑后,線粒體剩余量標(biāo)志TOM20、HSP60表達(dá)增加,線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1表達(dá)減少,肝纖維化指標(biāo)α-SMA及Collagen I表達(dá)增加,表明抑制線粒體自噬可促進(jìn)HSCs的活化。3線粒體自噬誘導(dǎo)劑抑制HSCs活化WB結(jié)果顯示,與單純TGF-β組比較,應(yīng)用線粒體自噬誘導(dǎo)劑后,線粒體剩余量標(biāo)志TOM20、HSP60減少,線粒體自噬相關(guān)蛋白PINK1表達(dá)增加,HSCs活化指標(biāo)α-SMA及Collagen I表達(dá)減少,結(jié)果提示誘導(dǎo)線粒體自噬能夠抑制HSCs活化。結(jié)論:在肝纖維化形成及HSCs活化中線粒體自噬受到抑制。抑制線粒體自噬能促進(jìn)HSCs活化,加重肝纖維化,而誘導(dǎo)線粒體自噬可抑制HSCs活化。干預(yù)線粒體自噬有望成為肝纖維化治療的新靶點。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2

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