本文關(guān)鍵詞：P364L突變對UGT1A1酶催化非結(jié)合膽紅素葡糖醛酸化的影響

  更多相關(guān)文章： 高膽紅素血癥 尿苷二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1 膽紅素 葡糖醛酸化 突變體

【摘要】：以非結(jié)合膽紅素升高為主的先天性高膽紅素血癥在臨床中并不罕見,其中最常見的為1901年Gilbert和Lereboullet發(fā)現(xiàn)的Gilbert綜合癥,其次為Arias在1962年發(fā)現(xiàn)的Crigler-Najjar綜合癥Ⅱ型(CNS-Ⅱ),最少見也最為致命的是1952年被Crigler和Najjar報(bào)道的Crigler-Najjar綜合癥Ⅰ型(CNS-Ⅰ)。GS、CNS-Ⅰ和CNS-Ⅱ發(fā)病機(jī)制相同,均為編碼尿苷二磷酸葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1(UDP-glucuronosyltransferase 1A1,UGT1A1)的基因發(fā)生突變,使突變的UGT1A1酶催化非結(jié)合膽紅素的活性下降。目前已發(fā)現(xiàn)了130個(gè)UGT1A1基因上的突變位點(diǎn),這些突變點(diǎn)大多位于外顯子1、2、5上,而外顯子3、4上的突變相對較少[1]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)了1例CNS-Ⅱ患者攜帶有外顯子上的純合突變c.1091CT。該突變點(diǎn)位于UGT1A1基因外顯子4上,使UGT1A1酶的第364個(gè)氨基酸由脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?P364L)。以往的研究中關(guān)于P364L突變的報(bào)道較少,在非亞洲人群中至今還沒有該突變位點(diǎn)的報(bào)道,而課題組發(fā)現(xiàn)的CNS-Ⅱ患者攜帶P364L純合突變,是目前為止報(bào)道的第1例。為明確P364L突變酶對非結(jié)合膽紅素催化能力的影響我們構(gòu)建變異體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。目的:UGT1A1基因外顯子4上的突變c.1091CT,導(dǎo)致UGT1A1酶的第364個(gè)氨基酸由脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?本實(shí)驗(yàn)旨在驗(yàn)證P364L突變酶催化非結(jié)合膽紅素葡糖醛酸化能力的下降。方法:以攜帶正常UGT1A1基因的野生型質(zhì)粒為模板,用核苷酸引物介導(dǎo)的定點(diǎn)突變法構(gòu)建攜帶c.1091CT基因的突變型質(zhì)粒。突變型質(zhì)粒測序并將測序結(jié)果與野生型質(zhì)粒比對,驗(yàn)證突變型質(zhì)粒是否構(gòu)建準(zhǔn)確。用突變型質(zhì)粒和野生型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,表達(dá)P364L突變酶和UGT1A1野生酶。提取用野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后表達(dá)的總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量方法分別檢測野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒表達(dá)的差異。超聲破碎儀裂解HEK293細(xì)胞,低溫高速離心后留取上清。Western blot驗(yàn)證UGT1A1野生酶及P364L突變酶的表達(dá)。繪制非結(jié)合膽紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線,用UGT1A1野生酶和P364L突變酶分別催化非結(jié)合膽紅素與尿苷二磷酸葡糖醛酸(Uridine diphosphate glucuronic acid,UDPGA)的結(jié)合反應(yīng),高效液相色譜儀(High performance liquid chromatograph,HPLC)定量分析非結(jié)合膽紅素濃度的變化,比較UGT1A1野生酶和P364L突變酶對非結(jié)合膽紅素葡糖醛酸化的催化活性。結(jié)果:1.測序結(jié)果顯示野生型質(zhì)粒UGT1A1基因的第4個(gè)外顯子上的第1091個(gè)堿基由鳥嘌呤(G)突變?yōu)橄汆堰?A),對應(yīng)到互補(bǔ)鏈為胞嘧啶(C)突變?yōu)樾叵汆奏?T),突變質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.Western blot檢測HEK293細(xì)胞轉(zhuǎn)染UGT1A1野生型和P364L突變型質(zhì)粒后的蛋白表達(dá),PVDF膜掃描顯示55KD左右處可見UGT1A1蛋白表達(dá)。3.提取野生型、突變型質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后表達(dá)的總RNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒表達(dá)無差異。4.繪制非結(jié)合膽紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到方程式:y=0.0571x+0.1011,R2=0.9946(其中X為非結(jié)合膽紅素峰面積,Y為非結(jié)合膽紅素濃度μg/m L),非結(jié)合膽紅素濃度在0.31255μg/m L~5μg/m L時(shí)與非結(jié)合膽紅素峰面積有良好的線性關(guān)系。5.用分別轉(zhuǎn)染P364L突變質(zhì)粒和UGT1A1野生質(zhì)粒后的HEK293細(xì)胞均漿催化非結(jié)合膽紅素與UDPGA的酯化反應(yīng),UGT1A1野生酶和P364L突變酶反應(yīng)組在15min內(nèi)非結(jié)合膽紅素濃度下降幅度最大,總體來講P364L突變酶催化組非結(jié)合膽紅素的濃度下降低于UGT1A1野生酶催化組。結(jié)論:UGT1A1基因外顯子4上的突變c.1091CT使其翻譯合成的P364L突變酶催化非結(jié)合膽紅素能力低于UGT1A1野生酶。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 牛會曉;;血清白蛋白與非結(jié)合膽紅素聯(lián)合檢測在新生兒黃疸中的臨床應(yīng)用價(jià)值[J];臨床醫(yī)學(xué);2013年02期

2 韓清錫;;非結(jié)合膽紅素性黃疸[J];醫(yī)師進(jìn)修雜志;1984年07期

3 劉秋玲;;血清白蛋白 非結(jié)合膽紅素檢測在新生兒黃疸中的臨床應(yīng)用[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2012年34期

4 羅福成 ,唐保元 ,陳鐘英;何謂肝炎后高膽紅素血癥?[J];江蘇醫(yī)藥;1983年03期

5 許臘梅;張予蜀;孫丹莉;;以非結(jié)合膽紅素增高為主要表現(xiàn)的Wilson病(附1例報(bào)告)[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2009年07期

6 李海鵬,楊期明,陳繼華,羅喬英,姚曉喜,李青,黃仁彬,熊波;非結(jié)合膽紅素在腦梗死急性期含量變化及臨床意義[J];南華大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2005年03期

7 呂祥兄;李曉彤;石海濤;;腦梗死急性期血紅素氧合酶-1、非結(jié)合膽紅素濃度變化與預(yù)后的關(guān)系[J];現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué);2010年03期

8 唐智雄;林振榮;譚軼軍;余雪文;;膽紅素水平對不同類型腦卒中患者的影響[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2007年07期

9 ;[J];;年期

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 唐怡;P364L突變對UGT1A1酶催化非結(jié)合膽紅素葡糖醛酸化的影響[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 穆雪峰;肝病患者非結(jié)合膽紅素升高的臨床意義[D];吉林大學(xué);2015年

，

本文編號：1301690