本文關鍵詞：靶向調控β-arrestin2的表達對肝纖維化星狀細胞膠原產生的影響

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【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis, HF)是肝組織內細胞外基質(extracellular matrix,ECM)過度增生與異常沉積,導致肝臟結構、功能異常的病理變化。肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)是肝纖維化ECM的主要來源。轉化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)是引起HSC活化并產生膠原的主要細胞因子。β-arrestin2屬于arrestin家族,是眾所周知的G蛋白偶聯受體的調節(jié)蛋白,同時作為支架蛋白和連接蛋白,參與受體在胞內的信號轉導。近年來研究顯示,β-arrestin2的異常表達與纖維化疾病的發(fā)生、發(fā)展有關。本研究探討β-arrestin2對HSC膠原產生的影響,及其機制是否與調節(jié)TGF-βⅢ型受體(the type Ⅲ TGF-β receptor, TβRⅢ)相關,為肝纖維化的防治提供新的靶點。本實驗首先建立了豬血清(porcine serum, PS)誘導的肝纖維化大鼠模型,檢測了造模不同時間點大鼠肝臟β-arrestin2、TGF-β1、TβRⅡ、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表達變化；體外以TGF-β1刺激的HSC做為膠原產生模型,檢測了TGF-β1刺激不同時間點HSC中β-arrestin2、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表達情況及Smad2、Smad3、Akt信號通路的激活情況。采用激光共聚焦、免疫共沉淀、針對TβRⅢ和β-arrestin2的小干擾RNA (small interfering RNA, siRNA),進一步探討β-arrestin2對HSC膠原生成的影響及與TPRIII的相互作用情況。目的：體外建立豬血清誘導的肝纖維化大鼠模型；體外選取大鼠HSC-T6細胞株,TGF-β1刺激不同時間,并采用TβRⅢ siRNA和β-arrestin2 siRNA干擾。觀察β-arrestin2、TβRⅢ、膠原表達及相關信號通路的變化,探討β-arrestin2與TβRⅢ的相互作用,闡明β-arrestin2在HSC膠原產生中的作用及機制,為防治肝纖維化提供新的靶點。方法：Wistar大鼠腹腔注射無菌豬血清,每周2次,誘導肝纖維化模型。分別于造模第3、6、9、12、16周末次注射24h后處死大鼠。Western blot法檢測肝臟中β-arrestin2、TGF-β1、TβRⅡ、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ表達水平的變化。體外選用HSC-T6細胞,Western blot法檢測TGF-β1刺激不同時間點(0.25 h、0.5h、1 h、4 h、8 h、12 h)HSC中β-arrestin2、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ表達變化,以及Smad2、Smad3、Akt信號通路的激活情況；分別使用針對TβRⅢ siRNA和β-arrestin2 siRNA轉染HSC,采用Western blot法檢測轉染后TβRⅢ、β-arrestin2、膠原的表達變化和Smad2、Smad3、Akt信號通路的激活情況；激光共聚焦和免疫共沉淀檢測β-arrestin2、TβRⅢ的相互作用。結果：1.豬血清誘導的肝纖維化模型大鼠肝臟中β-arrestin2、TGF-β1、TβRⅡ、TβRⅢ、 Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達情況Western blot檢測結果顯示,肝臟Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表達隨肝纖維化的.形成增高,β-arrestin2的表達也逐漸增高：同時,隨造模時間的延長TGF-β1的表達升高,而TβRⅢ隨之降低,TβRⅡ則無明顯變化。相關性分析結果表明,Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ與β-arrestin2的表達呈正相關,而TβRⅢ與β-arrestin2的表達呈負相關。2. TGF-β1刺激的HSC中β-arrestin2、TβRⅢ、CollagenⅠ、CollagenⅢ的表達變化,以及Smad2、Smad3和Akt信號通路的激活情況Western blot檢測結果顯示,TGF-β1刺激HSC不同時間點(0.25 h、0.5 h、1 h、4 h、8 h、 12 h),β-arrestin2的表達隨著TGF-β1的刺激時間延長而升高,TβRⅢ表達降低。Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達也明顯升高。p-Smad2、p-Smad3分別在0.5h和0.25h表達最高,p-Akt在4h達到最高。3. TβRⅢ siRNA轉染HSC后TβRⅢ、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達變化為了研究TβRⅢ在HSC中的作用,向HSC轉染了針對TβRⅢ的siRNA。 Western blot檢測結果發(fā)現,轉染TβRⅢ siRNA后,與對照組相比,HSC中TβRⅢ表達下降,而TGF-β1刺激的Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達升高。4. TβRⅢ siRNA轉染HSC后Smad2、Smad3和Akt信號通路的激活情況進一步研究TβRⅢ對TGF-β1激活的信號通路的影響,Western blot檢測了Smad2、Smad3和Akt的激活情況。結果發(fā)現,轉染TβRⅢ siRNA后,與對照組相比,可明顯促進TGF-β1刺激的HSC中Smad2、Smad3和Akt信號通路的激活。5. β-arrestin2、siRNA對HSC中β-arrestin2、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ表達的影響為了研究β-arrestin2對HSC膠原產生的影響,向細胞轉染了β-arrestin2 siRNA。 Western blot檢測發(fā)現,轉染β-arrestin2 siRNA后,與對照組相比,TGF-β1刺激的HSC中Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表達下降。6. β-arrestin2 siRNA轉染HSC對Smad2、Smad3和Akt信號通路激活的影響Western blot檢測發(fā)現,轉染β-arrestin2 siRNA后,與對照組相比,TGF-β1刺激的HSC中p-Smad2、p-Smad3和p-Akt的表達下降,而Smad2、Smad3和Akt的表達沒有明顯變化。7. TGF-β1刺激的HSC中β-arrestin2與TβRⅢ的相互作用激光共聚焦與免疫共沉淀結果顯示,β-arrestin2與TβRⅢ在TGF-β1刺激的HSC中存在共定位,TGF-β1刺激后,β-arrestin2與TβRⅢ共沉淀增強。轉染β-arrestin2 siRNA后,與對照組相比,細胞中TβRⅢ表達升高,但TβRⅢ和β-arrestin2的共沉淀作用無明顯變化。提示抑制β-arrestin2減弱β-arrestin2與TβRⅢ的相互作用,可能上調了TβRⅢ對Smad和Akt通路的抑制作用。結論：1.在肝纖維化大鼠造模過程中,Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達逐漸升高,β-arrestin2的表達也增高,而TβRⅢ的表達減少,TβRⅡ則無明顯變化。相關性分析結果提示,在肝纖維化過程中,β-arrestin2的表達與膠原表達成正相關,可能在HSC膠原生成的過程中發(fā)揮作用。2. TGF-β1刺激的HSC中,β-arrestin2、Collagen I、Collagen III的表達升高,TβRIII的表達降低。β-arrestin2與TβRIII在HSC中存在相互作用,且TGF-β1刺激后相互作用增強。3.HSC轉染針對TβRIII siRNA后,膠原相關蛋白的表達增高；同時,Smad2、Smad3和Akt信號通路激活水平升高。結果顯示,降低TβRIII的表達可能促進了Smad2、 Smad3和Akt信號通路的激活,進而促進了膠原表達。4.HSC轉染針對β-arrestin2 siRNA后,TGF-β1的刺激無法增強β-arrestin2與TβRIII的相互作用,轉染后細胞中膠原相關蛋白的表達被抑制,Smad2、Smad3和Akt信號通路的激活都得到了抑制。以上結果提示,β-arrestin2可能通過增強與TβRIII的作用,減弱了TβRIII對Smad2/3、Akt通路的抑制作用,進而促進膠原產生。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2

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