本文關(guān)鍵詞：黃芪甲苷對TL1A高表達(dá)慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠IL-9表達(dá)的影響

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【摘要】：炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)發(fā)病機(jī)制尚不十分明確,目前認(rèn)為腸黏膜免疫異常是IBD的重要病因之一,而CD4+T細(xì)胞是其免疫應(yīng)答的主要效應(yīng)細(xì)胞,在維持IBD免疫平衡中發(fā)揮著重要作用。Th9細(xì)胞是一種新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞亞群,主要分泌IL-9,近年研究發(fā)現(xiàn),Th9細(xì)胞及IL-9在IBD發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用,受到越來越多的關(guān)注。IL-9具有廣泛的生物學(xué)活性,在過敏性疾病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等多種自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。盡管Th9細(xì)胞在諸多自身免疫疾病中發(fā)揮重要作用,但目前有關(guān)Th9細(xì)胞在IBD領(lǐng)域的研究報(bào)道不多。研究發(fā)現(xiàn),Th9細(xì)胞與IL-9水平在UC患者和動(dòng)物結(jié)腸炎模型中均明顯升高,并且與結(jié)腸炎病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。應(yīng)用IL-9基因敲除小鼠制備的實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型腸道炎癥程度較WT組輕;應(yīng)用抗IL-9抗體腹腔注射治療急性結(jié)腸炎小鼠后,腸道炎癥下降。這些研究提示Th9細(xì)胞及其分泌的IL-9在IBD發(fā)病機(jī)制中可能發(fā)揮重要作用。腫瘤壞死因子樣配體1A(tumor necrosis factor ligand-related molecule1A,TL1A)是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤壞死因子家族新成員,與死亡受體3(death receptor 3,DR3)結(jié)合,引發(fā)腸道炎癥反應(yīng)。目前,TL1A調(diào)控Th9細(xì)胞功能的研究報(bào)道不多,在過敏性肺炎的研究中發(fā)現(xiàn),TL1A刺激Na?ve CD4+T細(xì)胞可促進(jìn)其向Th9分化,產(chǎn)生IL-9增多。在IBD領(lǐng)域,TL1A與Th9細(xì)胞及IL-9的關(guān)系尚未研究報(bào)道。黃芪甲苷(AstragalosideⅣ,AS-Ⅳ)是黃芪(Astragalus membranaceus)藥理活性的主要物質(zhì)之一。黃芪在IBD的治療中應(yīng)用較為廣泛,治療UC已被證實(shí)有效。研究發(fā)現(xiàn),TL1A在病毒性心肌炎中的表達(dá)升高,應(yīng)用AS-Ⅳ的干預(yù)后,能夠明顯下調(diào)TL1A表達(dá),從而減輕心肌損害。目前尚無AS-Ⅳ與TL1A在IBD領(lǐng)域的研究。目的:探討AS-Ⅳ對TL1A高表達(dá)慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠的治療作用,明確AS-Ⅳ能否通過下調(diào)TL1A表達(dá),抑制IL-9產(chǎn)生,以期為臨床IBD的治療提供一種新的有效藥物。方法:1采用real-time Q-PCR方法進(jìn)行LCK-CD2-TL1A-GFP基因型小鼠的鑒定與篩選。2通過硫酸葡聚糖(dextran sulfate sodium,DSS)建立慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型,將L-Tg小鼠與C57BL/6WT小鼠(體重20~22g,8-10周)分別隨機(jī)分為Control組、DSS組、AS-Ⅳlow dose組(20mg/kg.d)、AS-Ⅳhigh dose組(30mg/kg.d),每組10只。正常對照組引用蒸餾水,DSS組、AS-Ⅳlow dose組和AS-Ⅳhigh dose組間斷飲用2%DSS,飲用DSS的時(shí)間段分別為第1~5天、第8~12天、第15~19天、第22~26天,第27、28天及其余時(shí)間飲用蒸餾水,共四周。AS-Ⅳlow dose組和AS-Ⅳhigh dose組第14天開始給予黃芪甲苷灌胃治療。3每天觀察小鼠的一般狀況、體重變化、進(jìn)食以及大便情況,并評估疾病活動(dòng)指數(shù)(Disease activity index,DAI)。4觀察結(jié)腸形態(tài)學(xué)變化,測量結(jié)腸的長度,計(jì)算結(jié)腸形態(tài)學(xué)評分以及組織病理學(xué)評分和結(jié)腸組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)含量。5應(yīng)用Western blot技術(shù)和real-time Q-PCR技術(shù)分別檢測結(jié)腸組織中TL1A、DR3和IL-9蛋白及m RNA的表達(dá)水平。6提取腸黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞(Lamina propria mononuclear cells,LPMC),腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph nodes,MLN)以及脾臟中的單個(gè)核細(xì)胞并計(jì)數(shù),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FC)檢測Th9細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例,應(yīng)用酶聯(lián)吸附反應(yīng)試驗(yàn)(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)檢測細(xì)胞上清液及血清中的IL-9的水平。結(jié)果:(1)根據(jù)基因LCK-CD2-TL1A-GFP序列測定小鼠DNA,Tg小鼠目的基因測定成像在192 bp位置,而WT小鼠基因測定成像,在192 bp位置沒有檢測到目的基因,據(jù)此篩選并鑒定Tg小鼠。(2)與Control組相比,WT和Tg小鼠的DSS組小鼠體重明顯減輕,DAI評分明顯升高,結(jié)腸壁充血水腫,長度明顯縮短;結(jié)腸組織病理提示大量炎癥細(xì)胞浸潤,黏膜上皮形成淺潰瘍,病理評分明顯升高(WT小鼠:13.5±1.06 vs 3.25±0.46,P0.05;Tg小鼠:16.25±1.03 vs 3.38±0.51,P0.05);MPO活性明顯升高(P0.05)。與WT小鼠DSS組相比,Tg小鼠DSS組結(jié)腸炎癥明顯增加(P0.05)。給予AS-Ⅳ治療后,與DSS組相比,WT和Tg小鼠的AS-Ⅳlow dose組和AS-Ⅳhigh dose組小鼠體重明顯回升,DAI評分明顯下降,結(jié)腸腸壁充血水腫不明顯,長度縮短不明顯;病理評分明顯降低(WT小鼠:8.75±0.88 vs 13.5±1.06,P0.05;6±1.06 vs 13.5±1.06,P0.05;Tg小鼠:11.38±1.06 vs 16.25±1.03,P0.05;9.12±0.83 vs 16.25±1.03,P0.05);MPO活性明顯降低(P0.05)。AS-Ⅳhigh dose組小鼠治療效果更佳,與AS-Ⅳlow dose組相比結(jié)腸炎癥明顯降低(P0.05)。與Tg小鼠相比,WT小鼠治療效果更佳,結(jié)腸炎癥明顯降低(P0.05)。(3)Western blot和real-time Q-PCR檢測結(jié)腸組織中TL1A和IL-9蛋白及m RNA的表達(dá)水平,結(jié)果顯示:與control組相比,WT和Tg小鼠的DSS組小鼠上述蛋白及m RNA水平明顯升高,WT小鼠(TL1A m RNA:0.58±0.038 vs 0.01±0.02,P0.05;TL1A蛋白0.47±0.03 vs 0.15±0.05,P0.05;IL-9 m RNA:0.13±0.009 vs0.01±0.002,P0.05;IL-9蛋白0.44±0.02 vs 0.10±0.02,P0.05);Tg小鼠(TL1A m RNA:1.5±0.05 vs 0.26±0.045,P0.05;TL1A蛋白0.74±0.02 vs0.33±0.04,P0.05;IL-9 m RNA:0.16±0.011 vs 0.02±0.005,P0.05;IL-9蛋白0.73±0.02 vs 0.30±0.02,P0.05)。并且Tg小鼠較WT小鼠升高顯著(P0.05)。給予AS-Ⅳ治療后,WT和Tg小鼠的AS-Ⅳlow dose組和AS-Ⅳhigh dose組TL1A和IL-9蛋白及m RNA的表達(dá)水平明顯降低(P0.05),DR3蛋白及m RNA表達(dá)水平下降不明顯,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與AS-Ⅳlow dose組相比,WT小鼠AS-Ⅳhigh dose組IL-9蛋白及m RNA水平下降更明顯(P0.05),TL1A變化不明顯,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與AS-Ⅳlow dose組相比,Tg小鼠AS-Ⅳhigh dose組TL1A、IL-9蛋白及m RNA的表達(dá)水平均下降更明顯(P0.05)。與Tg小鼠相比,WT小鼠治療效果更佳,TL1A和IL-9蛋白及m RNA的表達(dá)水平明顯降低(P0.05)。(4)與control組相比,WT和Tg小鼠的DSS組小鼠LPMC、MLN中及脾臟中單個(gè)核淋巴細(xì)胞的數(shù)目明顯增加(P0.05),且Tg小鼠較WT小鼠增加顯著(P0.05)。給予AS-Ⅳ治療后,WT和Tg小鼠的AS-Ⅳlow dose組和AS-Ⅳhigh dose組上述細(xì)胞數(shù)目明顯下降(P0.05)。且與AS-Ⅳlow dose組相比,AS-Ⅳhigh dose組的上述細(xì)胞數(shù)目下降更明顯(P0.05)。與Tg小鼠相比,WT小鼠治療效果更佳,上述細(xì)胞數(shù)目下降更明顯(P0.05)。(5)與control組相比,WT和Tg小鼠的DSS組小鼠MLN中及脾臟中單個(gè)核淋巴細(xì)胞所包含的Th9細(xì)胞的比例明顯增加,WT小鼠(MLN中單個(gè)核淋巴細(xì)胞Th9比例:3.64%±0.22%vs 1.75%±0.021%,P0.05;脾臟中單個(gè)核淋巴細(xì)胞Th9比例:5.84%±0.1%vs 3.38%±0.29%,P0.05);Tg小鼠(MLN中單個(gè)核淋巴細(xì)胞Th9比例:9.63%±0.28%vs 1.64%±0.13%,P0.05;脾臟中單個(gè)核淋巴細(xì)胞Th9比例:9.53%±0.27%vs 2.36%±0.21%,P0.05)。并且Tg小鼠較WT小鼠增加顯著(P0.05)。給予AS-Ⅳ治療后,WT和Tg小鼠的AS-Ⅳlow dose組和AS-Ⅳhigh dose組上述細(xì)胞比例明顯下降(P0.05)。且與AS-Ⅳlow dose組相比,AS-Ⅳhigh dose組的上述細(xì)胞比例下降更明顯(P0.05)。與Tg小鼠相比,WT小鼠治療效果更佳,上述細(xì)胞比例下降更明顯(P0.05)。(6)ELISA檢測LPMC、MLN和脾臟中的單個(gè)核細(xì)胞上清液以及血清中的IL-9水平顯示:與control組相比,WT和Tg小鼠的DSS組小鼠LPMC、MLN和脾臟中單個(gè)核淋巴細(xì)胞上清液以及血清中的IL-9水平明顯升高,WT小鼠(LPMC分泌的IL-9水平:246.16 pg/m L±6.14 pg/m L vs 26.16 pg/m L±2.48 pg/m L,P0.05);Tg小鼠(LPMC分泌的IL-9水平:285 pg/m L±6.78 pg/m L vs 30.16 pg/m L±3.65pg/m L,P0.05)。并且Tg小鼠較WT小鼠升高顯著(P0.05)。給予AS-Ⅳ治療后,WT和Tg小鼠的AS-Ⅳlow dose組和AS-Ⅳhigh dose組IL-9水平明顯下降(P0.05)。且與AS-Ⅳlow dose組相比,AS-Ⅳhigh dose組的IL-9水平下降更明顯(P0.05)。與Tg小鼠相比,WT小鼠治療效果更佳,IL-9水平下降更明顯(P0.05)。結(jié)論:TL1A能夠促進(jìn)Th9細(xì)胞分泌IL-9進(jìn)而導(dǎo)致腸道炎癥,而AS-Ⅳ對慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠具有保護(hù)作用,并且呈劑量依賴性,可能是通過下調(diào)TL1A、抑制IL-9分泌而減輕腸黏膜炎癥。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R574.62

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本文編號：1281593