發(fā)布時間：2017-12-11 13:39

  本文關(guān)鍵詞：HBsAg與HBsAb雙陽性慢性乙肝病毒感染患者S蛋白氨基酸突變研究

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【摘要】：乙型肝炎病毒感染(hepatitis B Virus, HBV)是一個威脅人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題。據(jù)估計目前全球約有20億人曾感染過HBV,其中3.5億以上為慢性HBV感染者。世界范圍內(nèi),每年約有68.6萬人死于HBV感染所致的終末期肝臟疾病,如肝功能衰竭(hepatic failure, HF)、肝硬化(liver cirrhosis, LC)和肝細胞癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)。中國屬乙型肝炎病毒感染高發(fā)區(qū),目前我國有慢性HBV感染者約9300萬人,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者約2000萬人。HBV基因組由正鏈和負鏈組成雙鏈環(huán)狀DNA。其負鏈包含有4個開放性閱讀框(open reading frame, ORF),分別為S區(qū)、C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。S區(qū)中的S基因編碼主蛋白HBsAg,即S蛋白。S蛋白全長226個氨基酸殘基,包括N端(aa 1-99),主要親水區(qū)(aa 100-169)和C端(aa 170-226),其中“a”決定簇(aa 124-147)位于主要親水區(qū)內(nèi)�！癮”決定簇高度保守,為所有亞型所共有。其作用在于維持HBsAg的穩(wěn)定性、空間構(gòu)象以及免疫原性。此外,免疫應(yīng)答細胞和抗體通過定位這個區(qū)域以識別HBsAg,從而對所有HBV亞型產(chǎn)生抵抗力。血清HBsAg陽性代表現(xiàn)癥HBV感染；HBsAb為保護性中和抗體,陽性代表機體對HBV有免疫力。傳統(tǒng)觀念認為,HBsAb為保護性中和抗體,同一患者血清不可能同時檢測出HBsAg和HBsAb。隨著近些年國內(nèi)外關(guān)于HBsAg和HBsAb共存的報道越來越多,這對矛盾體的出現(xiàn)徹底挑戰(zhàn)了上述傳統(tǒng)觀點。研究表明,HBsAg+/HBsAb+患者發(fā)展為晚期肝病的機率較HBsAg+/HBsAb-高。HBsAg和HBsAb共存原因尚不明確,本研究旨在揭示HBsAg和HBsAb雙陽性與S蛋白氨基酸突變的關(guān)系。第一部分慢性HBV感染HBsAg與HBsAb雙陽患者臨床特征本研究旨在探索HBsAg和HBsAb共存患者的臨床特征。本課題組收集慢性HBV感染且HBsAg和HBsAb共存患者15例作為實驗組,選取同期22例HBsAg+/HBsAb-慢性HBV感染者作為對照組。抽取兩組患者外周血并分離血清,采用酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析技術(shù)定性及定量檢測兩組成員乙型肝炎血清學(xué)標志物；采用速率法檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；采用PCR-熒光探針法定量試劑盒檢測血清HBV DNA水平。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件比較分析兩組患者臨床特征,結(jié)果顯示兩組在患者年齡、性別、HBsAg滴度、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、HBeAg陽性率、基因型及血清HBV DNA水平之間的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。第二部分HBsAg與HBsAb雙陽患者S蛋白氨基酸突變分析本部分旨在利用PCR技術(shù)和分子克隆-DNA測序技術(shù),對HBsAg+/HBsAb+和HBsAg+/HBsAb-患者S蛋白氨基酸序列比對分析,從而揭示HBsAg和HBsAb共存與S蛋白氨基酸突變之間的聯(lián)系。本課題組使用試劑盒提取兩組患者血清HBV DNA;設(shè)計、合成擴增HBV S基因的引物并擴增兩組患者血清HBV S基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,經(jīng)純化、回收及克隆后行測序分析。運用Chromas軟件和Omiga軟件分析測序結(jié)果,并將所得氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的參考序列對比。最后運用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件分析比較兩組S蛋白氨基酸突變率之間的差異。結(jié)果顯示兩組氨基酸殘基突變最頻繁的位點是s126,只有實驗組成員存在T/I126A/S、P127T、G130E/N、M133S、F134I、T140I和G145R氨基酸突變;這些位點都被證實與HBsAg的免疫原性改變有關(guān)。主要親水區(qū)(p=0.000)和N端(p=0.029)的氨基酸突變率實驗組顯著高于對照組,而在C端(p=0.878)兩組無顯著性差異。特別重要的是,“a”決定簇內(nèi),實驗組的氨基酸突變率顯著高于對照組(p=0.008)；且對比“a”決定簇內(nèi)的兩個環(huán)形結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸突變率,兩組在第一環(huán)的氨基酸突變率有顯著性差異(p=0.006),而在第二環(huán)(p=0.687)兩組的突變率并無顯著差異。本研究揭示了HBsAg和HBsAb共存與S蛋白“a”決定簇及其周圍區(qū)域的氨基酸高頻率突變有關(guān),為后續(xù)探討這些區(qū)域的氨基酸突變導(dǎo)致HBsAg的免疫原性改變提供了重要的理論依據(jù),有利于臨床指導(dǎo)隨訪、判斷預(yù)后,為防止或延緩疾病進展為晚期肝病提供方案。綜上所述,慢性HBV感染HBsAg和HBsAb共存患者與HBsAg+/HBsAb-患者的臨床特征無統(tǒng)計學(xué)差異。HBsAg和HBsAb共存與S蛋白“a”決定簇及其周圍區(qū)域的氨基酸高頻率突變有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.62

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本文編號：1278684