本文關(guān)鍵詞：HBsAg與HBsAb雙陽(yáng)性慢性乙肝病毒感染患者S蛋白氨基酸突變研究

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【摘要】：乙型肝炎病毒感染(hepatitis B Virus, HBV)是一個(gè)威脅人類健康的全球性公共衛(wèi)生問(wèn)題。據(jù)估計(jì)目前全球約有20億人曾感染過(guò)HBV,其中3.5億以上為慢性HBV感染者。世界范圍內(nèi),每年約有68.6萬(wàn)人死于HBV感染所致的終末期肝臟疾病,如肝功能衰竭(hepatic failure, HF)、肝硬化(liver cirrhosis, LC)和肝細(xì)胞癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)。中國(guó)屬乙型肝炎病毒感染高發(fā)區(qū),目前我國(guó)有慢性HBV感染者約9300萬(wàn)人,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者約2000萬(wàn)人。HBV基因組由正鏈和負(fù)鏈組成雙鏈環(huán)狀DNA。其負(fù)鏈包含有4個(gè)開(kāi)放性閱讀框(open reading frame, ORF),分別為S區(qū)、C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。S區(qū)中的S基因編碼主蛋白HBsAg,即S蛋白。S蛋白全長(zhǎng)226個(gè)氨基酸殘基,包括N端(aa 1-99),主要親水區(qū)(aa 100-169)和C端(aa 170-226),其中“a”決定簇(aa 124-147)位于主要親水區(qū)內(nèi)�！癮”決定簇高度保守,為所有亞型所共有。其作用在于維持HBsAg的穩(wěn)定性、空間構(gòu)象以及免疫原性。此外,免疫應(yīng)答細(xì)胞和抗體通過(guò)定位這個(gè)區(qū)域以識(shí)別HBsAg,從而對(duì)所有HBV亞型產(chǎn)生抵抗力。血清HBsAg陽(yáng)性代表現(xiàn)癥HBV感染；HBsAb為保護(hù)性中和抗體,陽(yáng)性代表機(jī)體對(duì)HBV有免疫力。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為,HBsAb為保護(hù)性中和抗體,同一患者血清不可能同時(shí)檢測(cè)出HBsAg和HBsAb。隨著近些年國(guó)內(nèi)外關(guān)于HBsAg和HBsAb共存的報(bào)道越來(lái)越多,這對(duì)矛盾體的出現(xiàn)徹底挑戰(zhàn)了上述傳統(tǒng)觀點(diǎn)。研究表明,HBsAg+/HBsAb+患者發(fā)展為晚期肝病的機(jī)率較HBsAg+/HBsAb-高。HBsAg和HBsAb共存原因尚不明確,本研究旨在揭示HBsAg和HBsAb雙陽(yáng)性與S蛋白氨基酸突變的關(guān)系。第一部分慢性HBV感染HBsAg與HBsAb雙陽(yáng)患者臨床特征本研究旨在探索HBsAg和HBsAb共存患者的臨床特征。本課題組收集慢性HBV感染且HBsAg和HBsAb共存患者15例作為實(shí)驗(yàn)組,選取同期22例HBsAg+/HBsAb-慢性HBV感染者作為對(duì)照組。抽取兩組患者外周血并分離血清,采用酶聯(lián)免疫法和化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析技術(shù)定性及定量檢測(cè)兩組成員乙型肝炎血清學(xué)標(biāo)志物；采用速率法檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；采用PCR-熒光探針?lè)ǘ吭噭┖袡z測(cè)血清HBV DNA水平。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件比較分析兩組患者臨床特征,結(jié)果顯示兩組在患者年齡、性別、HBsAg滴度、血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、HBeAg陽(yáng)性率、基因型及血清HBV DNA水平之間的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。第二部分HBsAg與HBsAb雙陽(yáng)患者S蛋白氨基酸突變分析本部分旨在利用PCR技術(shù)和分子克隆-DNA測(cè)序技術(shù),對(duì)HBsAg+/HBsAb+和HBsAg+/HBsAb-患者S蛋白氨基酸序列比對(duì)分析,從而揭示HBsAg和HBsAb共存與S蛋白氨基酸突變之間的聯(lián)系。本課題組使用試劑盒提取兩組患者血清HBV DNA;設(shè)計(jì)、合成擴(kuò)增HBV S基因的引物并擴(kuò)增兩組患者血清HBV S基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,經(jīng)純化、回收及克隆后行測(cè)序分析。運(yùn)用Chromas軟件和Omiga軟件分析測(cè)序結(jié)果,并將所得氨基酸序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考序列對(duì)比。最后運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析比較兩組S蛋白氨基酸突變率之間的差異。結(jié)果顯示兩組氨基酸殘基突變最頻繁的位點(diǎn)是s126,只有實(shí)驗(yàn)組成員存在T/I126A/S、P127T、G130E/N、M133S、F134I、T140I和G145R氨基酸突變;這些位點(diǎn)都被證實(shí)與HBsAg的免疫原性改變有關(guān)。主要親水區(qū)(p=0.000)和N端(p=0.029)的氨基酸突變率實(shí)驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組,而在C端(p=0.878)兩組無(wú)顯著性差異。特別重要的是,“a”決定簇內(nèi),實(shí)驗(yàn)組的氨基酸突變率顯著高于對(duì)照組(p=0.008)；且對(duì)比“a”決定簇內(nèi)的兩個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu)區(qū)域的氨基酸突變率,兩組在第一環(huán)的氨基酸突變率有顯著性差異(p=0.006),而在第二環(huán)(p=0.687)兩組的突變率并無(wú)顯著差異。本研究揭示了HBsAg和HBsAb共存與S蛋白“a”決定簇及其周?chē)鷧^(qū)域的氨基酸高頻率突變有關(guān),為后續(xù)探討這些區(qū)域的氨基酸突變導(dǎo)致HBsAg的免疫原性改變提供了重要的理論依據(jù),有利于臨床指導(dǎo)隨訪、判斷預(yù)后,為防止或延緩疾病進(jìn)展為晚期肝病提供方案。綜上所述,慢性HBV感染HBsAg和HBsAb共存患者與HBsAg+/HBsAb-患者的臨床特征無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。HBsAg和HBsAb共存與S蛋白“a”決定簇及其周?chē)鷧^(qū)域的氨基酸高頻率突變有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.62

【相似文獻(xiàn)】

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