本文關(guān)鍵詞：MEAN通過干擾PTB抑制HCV復(fù)制

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【摘要】：研究背景與目的 丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus, HCV)是黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒,經(jīng)血液傳播、嗜肝性感染,引起急/慢性肝炎、肝硬化和肝癌。目前全球約有1.85億HCV感染者,感染率約為3%。每年新增感染者逾300萬,死亡約50萬。目前的療法成功率僅有45%左右,而且周期長,副作用大。迄今全球仍沒有HCV預(yù)防性疫苗,不能阻斷HCV的傳播。在今后相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)丙肝仍然是威脅人類健康的重要傳染病。因此積極尋找有效治療HCV的辦法至關(guān)重要。多嘧啶序列結(jié)合蛋白(polypyrimidine tract binding protein, PTB)作為一種普遍存在的多效應(yīng)細(xì)胞因子,與多種病毒的生命周期相關(guān)。在核內(nèi)參與前mRNA的選擇性剪接,在胞質(zhì)中調(diào)節(jié)包括HCV在內(nèi)的多種病毒的翻譯和復(fù)制過程。因此,PTB在HCV RNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用。本研究擬用JCl-Luc嵌合病毒感染Huh7.5.1細(xì)胞構(gòu)建HCV細(xì)胞模型,探討小分子化合物MEAN (6-methoxyethylamino-numonafide)對(duì)PTB質(zhì)核穿梭及HCV復(fù)制的影響。 研究方法 1. MEAN抗HCV效果分析 96孔細(xì)胞芯片板中,濃度梯度(0,0.31,0.63,1.25,2.5,5,10,20μM)的MEAN作用Huh7.5.1細(xì)胞72h,實(shí)時(shí)無標(biāo)記細(xì)胞分析(real time cellular analysis, RTCA)技術(shù)檢測(cè)MEAN的細(xì)胞毒性。HCV JC1質(zhì)粒體外制備HCV RNA轉(zhuǎn)錄體后轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞,收集細(xì)胞上清再次孵育Huh7.5.1細(xì)胞以建立HCV感染細(xì)胞模型(Huh7.5.1-JC1),感染后24h給予濃度梯度(0,0.63,1.25,2.5,5,10μM)的MEAN處理細(xì)胞48h后檢測(cè)熒光素酶水平判斷MEAN抗HCV效果。并通過Q-PCR和western blot分別檢測(cè)HCV RNA及核心蛋白(Core)的水平驗(yàn)證MEAN的抗HCV效應(yīng)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Core蛋白進(jìn)一部驗(yàn)證MEAN對(duì)HCV感染的抑制效果。MEAN對(duì)E2突變株N415D和G451R病毒復(fù)制的效應(yīng)以及MEAN與干擾素α (Interferon α, IFN α)、ITX5061及利巴韋林(Ribavirin, RBV)聯(lián)合藥效也通過檢測(cè)熒光素酶水平進(jìn)行評(píng)估。 2. MEAN抗HCV的機(jī)制研究 HCV IRES雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Huh7.5.1細(xì)胞24h后給予MEAN處理48h后檢測(cè)雙熒光素酶水平研究MEAN對(duì)HCV IRES介導(dǎo)的翻譯的影響。siRNA干擾實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PTB在HCV復(fù)制中的作用。此外,Q-PCR, western blot、免疫熒光實(shí)驗(yàn)及異核體實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MEAN對(duì)PTB表達(dá)水平及其胞核-胞質(zhì)穿梭的影響。mRNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MEAN對(duì)PTB mRNA穩(wěn)定性的影響。 研究結(jié)果 1. MEAN抑制HCV復(fù)制 1)熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)MEAN可以高效抑制JC1病毒復(fù)制(p0.05),半數(shù)有效濃度(EC50)為2.36±0.29州。 2) Q-PCR和western blot結(jié)果顯示MEAN劑量依賴性的抑制HCV RNA及核心蛋白水平(p0.05),進(jìn)一步證實(shí)了MEAN對(duì)HCV復(fù)制的抑制效應(yīng)。 3)免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示MEAN可顯著減少Core+細(xì)胞。 4)熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)MEAN可以顯著抑制突變病毒N415D及G451R的復(fù)制,EC50分別為3.56±0.08和3.71±0.14μM。 5)藥物聯(lián)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MEAN與IFN α、ITX5061和RBV可協(xié)同抑制HCV的復(fù)制。 2.MEAN抑制PTB的表達(dá)及其質(zhì)核穿梭 1)雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)證實(shí)MEAN對(duì)HCV IRES介導(dǎo)的翻譯抑制效果不明顯(p0.05)。 2) siRNA干擾PTB表達(dá)后,HCV復(fù)制水平顯著降低(p0.05)。 3) Q-PCR和Western Blot證實(shí),HCV感染后PTB表達(dá)顯著升高；而MEAN可抑制其高表達(dá)(p0.05)。 4) mRNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)證實(shí)MEAN可縮短PTB mRNA半衰期。 5) western blot和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)HCV感染后PTB的胞核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)位增強(qiáng),MEAN可抑制其胞核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)位(p0.05)。 6)異核體實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)MEAN可抑制EGFP-PTB的胞核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)位。研究結(jié)論 1. MEAN顯著抑制HCV復(fù)制。 2. MEAN通過抑制PTB胞核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)位發(fā)揮抗HCV效應(yīng)。 3. MEAN通過縮短PTB mRNA的半衰期而抑制其胞核-胞質(zhì)轉(zhuǎn)位。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.63

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1275028