本文關鍵詞：PNPLA3基因I148M多態(tài)性在非酒精性脂肪性肝纖維化中的機制研究

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【摘要】：目的：在動物和細胞水平上探究PNPLA31148M基因多態(tài)性對Hedgehog (Hh)信號通路表達的影響,從而揭示PNPLA3 I148M基因多態(tài)性在非酒精性脂肪性肝纖維化中作用機制。方法：采用顯微注射法構建了野生型純合子(PNPLA3+/+)、雜合子(PNPLA3148M/+)、突變型純合子(PNPLA3148M/M)三種轉基因小鼠模型,在相同環(huán)境下,采用正常飲食、飲水飼養(yǎng)16周后,將小鼠在乙醚麻醉后迅速解剖,從心臟采取血液標本,檢測血清中的TG、TC、ALT、AST的水平,獲取小鼠新鮮的肝臟組織標本,采用熒光定量PCR的檢測Hh信號通路基因以及與細胞增殖凋亡相關基因的表達,采用western blot在蛋白水平上對上述基因的表達進行驗證。在細胞實驗方面,運用雙酶切的方法合成PNPLA3 I148M野生型及突變型的基因序列和慢病毒載體序列,將目的基因序列和載體序列進行連接,合成攜帶目的基因的載體質粒并對其純化擴增及轉染293T細胞,從而獲得高滴度攜帶PNPLA3不同基因型的慢病毒；采用慢病毒轉染的方法轉染HSC-T6細胞,利用嘌呤霉素對轉染的HSC-T6細胞株進行篩選,構建能夠穩(wěn)定表達PNPLA3 I148M野生型和突變型基因細胞系,在此基礎上,分別檢測過表達PNPLA3 I148M野生型和突變型基因的HSC-T6細胞內(nèi)Hh信號通路及與細胞增殖凋亡相關基因的表達情況,并采用Western blot進行蛋白水平上的驗證。定量資料以“均數(shù)±標準差”進行表述,采用獨立樣本t檢驗對定量資料進行統(tǒng)計學分析；檢驗標準設定為P0.05。結果：(1)與PNPLA3+/+小鼠相比,PNPLA3148M/M小鼠血清中ALT水平高于PNPLA3+/+小鼠,結果有統(tǒng)計學意義。(2)與PNPLA3+/+小鼠相比,PNPLA3148M/+和PNPLA3148M/M小鼠肝臟組織內(nèi)shh、patched、smo、gli-1等基因的表達明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義。(3)與PNPLA3+/+小鼠相比,我們發(fā)現(xiàn)PNPLA3148M/+和PNPLA3148M/M小鼠肝臟組織內(nèi)bcl-2, PDGF和TGFβ1等基因的表達明顯增高,差異具有統(tǒng)計學意義。(4)成功組裝了攜帶PNPLA3 I148M野生型和突變型基因的慢病毒,并成功感染了HSC-T6細胞,采用倒置熒光顯微鏡觀察,綠色熒光陽性率達到85%,采用嘌呤霉素篩選后,陽性率達到95%以上。采用Western blot驗證野生型組和突變型組細胞內(nèi)PNPLA3蛋白較空載體對照組細胞表達增加,證實過表達PNPLA3 I148M野生型和突變型基因的HSC-T6細胞株構建成功。(5)PNPLA3 I148M突變基因過表達的HSC-T6細胞系內(nèi)shh、patched、smo、gli-1等基因的相對表達量明顯高于野生型細胞組,差異具有統(tǒng)計學意義。(6)與PNPLA3 I148M野生型細胞相比,突變型細胞內(nèi)bcl-2, PDGF和TGFβ1表達明顯上調(diào),差異具有統(tǒng)計學意義。結論：PNPLA3 I148M基因突變可能通過促進Hh信號通路的激活,引起肝星狀細胞的增殖和活化,在非酒精性脂肪性肝纖維化的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：1273240