本文關(guān)鍵詞：腺病毒介導(dǎo)的MMP-8截短體融合HGF雙突變體1K1促進(jìn)肝細(xì)胞增殖及緩解肝硬化的體內(nèi)外研究

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【摘要】：背景：肝纖維化是絕大多數(shù)類型的慢性肝臟疾病的一個顯著特征,是肝臟對各種慢性損傷產(chǎn)生的一種保護(hù)性的反應(yīng),是一種可逆性的瘢痕形成反應(yīng)。在許多患者,肝硬化的病因尚不明確�？赡艿恼T因很多,包括：病毒、自身免疫、藥物、酒精、膽汁淤積和代謝等種種因素,其臨床表現(xiàn)也變化多端,從沒有臨床表現(xiàn)僅依靠相關(guān)檢查確定,到后期的肝功能衰竭,均為肝硬化臨床表現(xiàn)的范疇。肝硬化的病人,具有較高的死亡率,而且接近70%的死亡病人是由肝臟疾病引起的。對于肝纖維化治療方法的研究,大部分是基于其發(fā)病機(jī)理進(jìn)行的。綜合起來,其研究主要可以分為3個方面：促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖、抑制肝星狀細(xì)胞的功能或者活性、降解肝纖維化過程中集聚的膠原。在其他的治療方面,肝移植和誘導(dǎo)肝纖維化的原發(fā)病的控制也很重要。目的：本研究中,我們通過蛋白質(zhì)工程的原理構(gòu)建了一個融合蛋白CMMP8-1K1,應(yīng)用腺病毒載體來提高其感染效率和增加在肝臟中的分布,通過這種方式將其應(yīng)用到70%肝切除和肝硬化小鼠模型中,擬通過這種基因治療的方式觀察融合蛋白對肝硬化的治療／緩解作用,并根據(jù)此實(shí)驗(yàn)提供的信息,在體外細(xì)胞水平上對融合蛋白在肝硬化治療／緩解中的作用機(jī)制進(jìn)行探討,為肝硬化的治療提供一個新的思路。方法：1,通過化學(xué)合成的方式,合成融合蛋白的基因序列,并將其構(gòu)建到腺病毒載體中,通過病毒包裝獲得含有目的基因的腺病毒；2,將含有目的基因的腺病毒／對照腺病毒通過尾靜脈注射的方式注射入70%肝切除和肝硬化模型小鼠中,通過觀察其在小鼠中的分布及通過對小鼠肝組織、血清及其他相關(guān)組織的染色、免疫印跡、ELISA等方法檢測融合蛋白對70%肝切除和肝硬化小鼠的作用；3,通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的研究,我們在體外的HL-7702細(xì)胞、LX2細(xì)胞、Ⅰ型膠原中對融合蛋白緩解肝硬化的機(jī)制進(jìn)行探討,通過檢測細(xì)胞增殖、凋亡、免疫印跡、PAGE等方法探討融合蛋白緩解肝硬化的機(jī)制。結(jié)果：1,通過化學(xué)合成的方式,合成融合蛋白的基因序列,并將其構(gòu)建到腺病毒載體中,通過病毒包裝獲得含有目的基因的腺病毒,測序結(jié)果正確,病毒滴度滿足實(shí)驗(yàn)需求。2,將含有目的基因的腺病毒／對照腺病毒通過尾靜脈注射的方式注射入70%肝切除的小鼠中,結(jié)果顯示融合蛋白具有促進(jìn)肝細(xì)胞增殖的作用,并且還可以保護(hù)肝功能；3,將含有目的基因的腺病毒／對照腺病毒通過尾靜脈注射的方式注射入肝硬化小鼠模型,在形態(tài)學(xué)上,融合蛋白可以促進(jìn)肝硬化的緩解,使α-SMA、TGF-β1的表達(dá)減少,膠原沉積減少；在功能上,同樣可以保護(hù)肝功能,促進(jìn)PCNA的表達(dá)；4,在體外,融合蛋白可以促進(jìn)肝細(xì)胞株HL-7702的增殖,使PCNA表達(dá)增加,并且促進(jìn)c-Met, Mek, erk的磷酸化增加；對肝星狀細(xì)胞株LX2,融合蛋白可以抑制TIMP-1、α-SMA, TGF-β1. COLI/III的表達(dá),并且增加5-FU誘導(dǎo)的LX2細(xì)胞凋亡；5,不僅如此,融合蛋白對可溶性Ⅰ型膠原在體外也具有降解作用,可以將120KD的Ⅰ型膠原降解為85KD和35KD的兩種片段。結(jié)論：1,融合蛋白通過腺病毒注射的方式具有肝臟富集作用,并且可以促進(jìn)肝臟增生、緩解肝硬化、保護(hù)肝功能；2,融合蛋白在體外可以通過促進(jìn)c-Met, Mek, erk的磷酸化增加促進(jìn)肝細(xì)胞增殖；并且減少肝星狀細(xì)胞TIMP-1、α-SMA、TGF-β1、COL I/III的表達(dá),并且增加5-FU誘導(dǎo)的LX2細(xì)胞凋亡；；3,融合蛋白對可溶性Ⅰ型膠原在體外也具有降解作用,可以將120KD的Ⅰ型膠原降解為85KD和35KD的兩種片段。因此,融合蛋白在體外具有直接的膠原降解作用。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2

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本文編號：1269888