本文關(guān)鍵詞：不同濃度的腫瘤壞死因子-α在急性肝損傷中的雙重作用及機制研究

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【摘要】：研究背景及目的:急性肝損傷是臨床上較為常見的一種疾病,發(fā)病急、進(jìn)展快、病情重是其特點,因此亟需明確診斷和治療。它是介于惡化和康復(fù)轉(zhuǎn)歸的一種特殊臨界狀態(tài),如果治療及時,肝損傷很可能得以控制,并逐漸轉(zhuǎn)愈;反之,則可能惡化,甚至轉(zhuǎn)變?yōu)楦嗡ソ?嚴(yán)重危害健康。急性肝損傷可由多種疾病發(fā)展而來,如病毒性肝炎、藥物性肝損傷、肝切除、肝移植、內(nèi)毒素性肝損傷、肝缺血再灌注等。這些疾病通常會引起肝細(xì)胞血流的改變,進(jìn)而造成不同程度的肝細(xì)胞缺氧,從而引起肝組織的損傷。炎癥微環(huán)境對組織損傷的發(fā)生發(fā)展具有重要的作用。而基于對調(diào)控炎癥微環(huán)境治療損傷性疾病越來越受到重視。急性肝損傷的發(fā)病機制極其復(fù)雜,其病情的發(fā)生和發(fā)展和炎癥微環(huán)境的改變密切相關(guān)。早期階段,肝組織內(nèi)的庫普弗細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)和巨噬細(xì)胞被激活后釋放活性氧(reactive oxygen species,ROS)和一些炎癥因子,如白介素類和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)。其中TNF-α在調(diào)節(jié)急性肝損傷過程中發(fā)揮著重要的作用。TNF-α是一種具有多態(tài)性的細(xì)胞因子,能調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞凋亡、新陳代謝等。TNF-α的這些生物活性和其重要的調(diào)節(jié)功能,與急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明在急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展過程中,TNF-α大量生成并啟動和調(diào)節(jié)其它炎癥因子的生成;同時TNF-α快速進(jìn)入損傷的肝細(xì)胞中,誘導(dǎo)啟動核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(nuclear factor-κB,NF-κB)的信號通路的表達(dá),共同參與肝細(xì)胞的修復(fù)過程。然而,有一些文獻(xiàn)報導(dǎo)TNF-α在急性肝損傷過程中,加重?fù)p傷的惡化。它通過激活肝細(xì)胞內(nèi)的一系列信號通路,最終啟動凋亡程序加速肝細(xì)胞的死亡。另外有文獻(xiàn)報導(dǎo)臨床上患者血清中TNF-α升高與病情惡化的程度呈正相關(guān)性。盡管目前對TNF-α的研究有著比較深入的了解,但是對于TNF-α在急性肝損傷的具體作用尚不明確�；谏鲜鲅芯勘尘�,我們實驗對此進(jìn)行了深入研究。首先制備了四氯化氮(Carbon tetrachloride,CCl_4)皮下注射誘導(dǎo)大鼠急性肝損傷模型;并應(yīng)用不同劑量的TNF-α抑制劑TNFR2融合蛋白變異體(TNFR2-Fc variants,TNFR2-Fcv,是一種基因合成的可溶性蛋白,能與TNF-α結(jié)合并抑制其活性)來觀察不同濃度的TNF-α對急性肝損傷的作用,并探索可能的機制。研究方法:(1)急性肝損傷模型的制備:CCl_4溶解在玉米油中,配制成40%的濃度。先將TNFR2-Fcv溶液腹腔注射到不同分組的雄性SD大鼠體內(nèi)。15分鐘以后,再將1ml/kg的CCl_4皮下注射到相應(yīng)組的大鼠體內(nèi)。24小時以后,大鼠全部被處死,收集血液和分離新鮮的肝組織,用于后續(xù)的實驗。(2)實驗分組及處理:將90只體重在200至210g之間的雄性SD大鼠,隨機分為9組,平均每組10只。這些大鼠分別予以CCl_4(-)+0mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(-)+8mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+0mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+0.25mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+0.5mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+1mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+2mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+4mg/kg TNFR2-Fcv、CCl_4(+)+8mg/kg TNFR2-Fcv處理;同時我們采用TNF-α-/-大鼠給予1ml/kg的CCl_4皮下注射并將這些處理組的大鼠放置在SPF級動物房飼養(yǎng)。輔以25±3°C的室溫下,12小時晝夜交替光照,并配以標(biāo)準(zhǔn)的飼料和清潔的飲水。(3)血清TNF-α水平的檢測:用ELISA檢測分析不同劑量的TNFR2-Fcv作用于急性肝損傷大鼠后,血清中TNF-α的濃度,以明確體內(nèi)不同濃度的TNF-α對急性肝損傷的作用。(4)肝損傷的檢測:從血液中析出血清,在自動分析儀中檢測各組血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate transaminase,AST)的水平。將肝組織石蠟包埋后制成組織切片,HE染色分析各組肝組織切片的脂肪變性程度;免疫組化技術(shù)和Tunnel試劑盒檢測組織切片中Cleaved-caspase3的表達(dá)和肝細(xì)胞凋亡的水平,判斷各組肝損傷的程度。(5)炎癥因子水平的檢測:實時定量PCR(Real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測急性肝損傷過程中,體內(nèi)不同濃度TNF-α對炎癥因子如IL-4、IL-6、IL-8、IL-1β和IFN-γ等的表達(dá)影響。(6)NF-κB信號通路及抗凋亡基因的檢測:Western-Blotting檢測不同濃度的TNF-α在急性肝損傷過程中NF-κB信號通路的表達(dá)包括IκBα(inhibitor of NF-kappa B-α)、p-IκBα(Phospho-IκBα)和NF-κB-p65的表達(dá)。以及RT-PCR和Western-Blotting檢測相關(guān)抗凋亡基因的表達(dá)如BCL-2(B-cell leukemia lymphoma 2)、BCL-XL(B-cell lymphoma-extra large)、XIAP(X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein),和FHC(Ferritin heavy chain)。(7)統(tǒng)計學(xué)分析:數(shù)據(jù)結(jié)果采用統(tǒng)計軟件SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,各組之間的均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)誤采用方差分析(Analysis of Variance,ANOVA)進(jìn)行檢驗分析,以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,兩組之間的差別采用Student-T檢驗,P0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。研究結(jié)果:(1)在CCl_4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型中,血清TNF-α的濃度隨著TNF-α抑制劑TNFR2-Fcv劑量的增加而逐漸下降,呈明顯的相關(guān)性。(2)在CCl_4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷模型中,血清ALT和AST明顯上升,即ALT:從36.75±8.73 U/L上升至193.27±14.26 U/L;AST:從150.86±12.34 U/L上升至253.79±12.90 U/L,p0.01。HE染色發(fā)現(xiàn)肝組織中有大量的脂肪變性,同時免疫組化染色Cleaved-caspase3陽性的細(xì)胞數(shù)量明顯增多、Tunnel凋亡試劑染色發(fā)現(xiàn)凋亡的肝細(xì)胞數(shù)目增多和Western-Blotting檢測凋亡抗體表達(dá)增強。(3)在正常大鼠中,無論TNF-α抑制劑TNFR2-Fcv劑量如何改變,血清ALT和AST水平基本不變,基本處于正常范圍之內(nèi)。而在CCl_4誘導(dǎo)大鼠的急性肝損傷模型中,隨著TNFR2-Fcv的劑量從0mg/kg逐漸遞加到8mg/kg時,體內(nèi)TNF-α水平逐漸下降,血清ALT和AST水平的變化呈明顯的“V”字型改變,即TNFR2-Fcv從0mg/kg增加至1mg/kg時,血清ALT和AST的值逐漸下降(P0.01);HE染色發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性的程度減輕;免疫組化和Tunnel檢測到凋亡的肝細(xì)胞數(shù)目明顯減少(P0.05)。然而,隨著TNFR2-Fcv的劑量進(jìn)一步加大,從1mg/kg增加至8mg/kg時,TNF-α的濃度繼續(xù)降低(至8mg/kg時,TNF-α接近于0pg/ml),血清ALT和AST的值反而逐漸上升,甚至在8mg/kg時,ALT和AST水平較0mg/kg時要高(P0.05);HE染色發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞脂肪變性的程度反而加重;免疫組化和Tunnel檢測到凋亡的肝細(xì)胞數(shù)目也大幅度增多(P0.05)。(4)在TNF-α-/-的大鼠中,CCl_4誘導(dǎo)急性肝損傷時,血清ALT和AST水平較野生型正常大鼠的明顯升高(P0.01);HE染色觀察到單視野肝脂肪變性十分嚴(yán)重。(5)RT-PCR的結(jié)果提示在急性肝損傷過程中,隨著TNFR2-Fcv劑量的增加,TNF-α濃度逐漸下降,促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β和IFN-γ水平逐漸下降,而抑炎因子IL-4的水平反而逐漸上升。(6)Western-Blotting和RT-PCR實驗結(jié)果表明在急性肝損傷過程中隨著TNF-α濃度逐漸下降,NF-κB信號通路基因p-IκBα和NF-κB-p65的表達(dá)以及抗凋亡基因包括Bcl-XL、FHC、XIAP和Bcl-2的表達(dá)也逐漸下降。結(jié)論:(1)TNF-α在調(diào)節(jié)急性肝損傷過程中發(fā)揮著重要的作用,適當(dāng)?shù)亟档腕w內(nèi)TNF-α濃度可有效地緩解肝損傷,然而,過度地降低TNF-α濃度反而會加重肝損傷。(2)TNF-α的損害和保護(hù)的雙重作用始終貫穿在急性肝損傷的發(fā)生和發(fā)展過程。其濃度與主要發(fā)揮的效應(yīng)密切相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575

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本文編號：1229985