發(fā)布時(shí)間：2017-11-23 02:05

  本文關(guān)鍵詞：5-氨基乙酰丙酸結(jié)合二價(jià)鐵對非酒精性脂肪肝缺血再灌注治療的機(jī)理研究

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【摘要】：各種實(shí)驗(yàn)室的評估數(shù)據(jù)表明非酒精性脂肪肝病已變?yōu)槭澜绶秶鷥?nèi)成年人最常見的慢性肝病,發(fā)病人數(shù)仍在世界范圍內(nèi)增長。非酒精性脂肪肝(non alcoholic fatty liver disease,NAFLD)疾病譜系包括單純性脂肪肝、非酒精性肝炎、肝硬化、肝癌。其中單純性脂肪肝又最為常見,肝臟的脂肪性變是單純性脂肪肝的重要特征。肝臟在人生命活動中起著重要作用,而且其功能十分復(fù)雜。一旦肝臟發(fā)生病變并到了終末期,先階段的內(nèi)科治療尚無法恢復(fù)肝臟的全部功能。最好的辦法就是換上一個(gè)或者是一部分健康肝臟。然而需進(jìn)行肝移植和肝切除的肝病患者數(shù)量急劇增加,但由于缺乏足夠的的正常肝臟組織供體而不得不使用脂肪肝替代健康的正常肝臟的現(xiàn)象越來越多,然而,脂肪肝對肝臟手術(shù)過程中發(fā)生的肝臟缺血再灌注(hepatic ischemia reperfusion)引起的急性肝損傷的耐受性更低,使得肝移植手術(shù)后喪失肝功能的幾率和風(fēng)險(xiǎn)變的更大。針對這種情況我們希望找到更簡便而且有效的緩解脂肪肝缺血再灌注損傷的方法。5-氨基乙酰丙酸(5-Aminolevulinic acid,5-ALA)是一種內(nèi)源性氨基酸,可以在動植物的線粒體中自主合成,目前作為一種在腫瘤診斷和治療中使用的新型光敏劑和治療劑。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)5-氨基乙酰丙酸結(jié)合二價(jià)鐵(5-ALA+Fe2+)可以通過激活MAPK通路,通過活化Nrf2的的途徑增強(qiáng)的血紅素-氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)的表達(dá)。HO-1是抗氧化酶的一種,功能為使血紅素轉(zhuǎn)化為膽紅素或者膽綠素、CO還有鐵離子,而這些代謝產(chǎn)物又有抗炎癥反應(yīng),抗氧化反應(yīng)等等保護(hù)作用。為此,研究使用高脂飲食并且不含膽堿和蛋氨酸(high fat,methionine-cholinedeficient diet,MCDHF)的飲食建立非酒精性脂肪肝病的小鼠模型,并模仿肝移植手術(shù)過程中經(jīng)歷的肝缺血再灌注過程建立小鼠的肝臟缺血再灌注模型,隨后將兩種模型結(jié)合形成小鼠非酒精性脂肪肝缺血再灌注模型,并應(yīng)用5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)結(jié)合二價(jià)鐵(Fe2+/SFC)在非酒精性脂肪肝小鼠的肝臟缺血再灌注模型中驗(yàn)證其對急性肝損傷的保護(hù)作用。主要實(shí)驗(yàn)和結(jié)果如下:實(shí)驗(yàn)一:模仿肝移植手術(shù)過程中經(jīng)歷的肝缺血再灌注過程建立了小鼠的肝臟缺血再灌注模型。采用暴露肝臟門靜脈,無創(chuàng)金屬夾夾閉門靜脈主干。在用0.5ml生理鹽水潤濕后,用快速閉合器關(guān)閉腹腔切口,15分鐘后恢復(fù)肝門血流1小時(shí)和3小時(shí),均得到了可靠的小鼠肝臟缺血再灌注模型。該模型AST、ALT較正常小鼠顯著升高。缺血再灌注模型肝臟組織HE染色發(fā)現(xiàn)有明顯的炎性細(xì)胞浸潤并伴輕微的肝細(xì)胞凋亡發(fā)生。結(jié)果顯示此方法可以建立穩(wěn)定的小鼠肝臟缺血再灌注模型。實(shí)驗(yàn)二:建立使用高脂并且缺乏膽堿和蛋氨酸的飲食造成的非酒精性脂肪肝和肝纖維化小鼠模型。并在其基礎(chǔ)上建立了非酒精性脂肪肝小鼠的肝臟缺血再灌注模型。同時(shí)建立了小鼠由單純性脂肪肝發(fā)展而成的肝纖維化或肝硬化模型。he染色和masson染色結(jié)果顯示3周mcdhf飲食(mcdhf3w)可以導(dǎo)致小鼠大泡性脂肪肝產(chǎn)生,10周mcdhf飲食(mcdhf10w)可以導(dǎo)致小鼠肝臟在脂肪肝的基礎(chǔ)上發(fā)生明顯的纖維化。mcdhf3w組與mcdhf10w組小鼠血清ast、alt比正常飲食小鼠顯著升高。同時(shí)mcdhf10w組血清ast、alt比mcdhf3w組高,但無顯著差異。實(shí)時(shí)定量rt-pcr的結(jié)果顯示mcdhf3w組小鼠炎性細(xì)胞因子:腫瘤壞死因子!(tumornecrosisfactoralpha,tnf-!),一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,inos),骨調(diào)素(osteopontin,opn)較正常飲食組小鼠明顯升高。使用流式細(xì)胞儀分析mcdhf誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝3周組和正常小鼠組,比較不同種類非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(non-parenchymalcells,npc)的數(shù)量變化。結(jié)果顯示mcdhf3w組cd8陽性t細(xì)胞的數(shù)量顯著高于正常小鼠,cd11b和b220陽性細(xì)胞的數(shù)量反而有所下降。于mcdhf3w模型小鼠行15分鐘缺血后1小時(shí)(mcdhfi/r1h)或3小時(shí)(mcdhfi/r3h)再灌注,小鼠組血清ast、alt較mcdhf3w小鼠顯著升高,而且mcdhfi/r1h組高于mcdhfi/r3h組,但無顯著性差異。其結(jié)果與組織學(xué)觀察結(jié)果吻合。顯示可以建立穩(wěn)定可靠的非酒精性脂肪肝/肝纖維化小鼠模型和非酒精性脂肪肝小鼠的肝臟缺血再灌注模型。實(shí)驗(yàn)三:應(yīng)用ala+fe2+在非酒精性脂肪肝小鼠的肝臟缺血再灌注模型中驗(yàn)證其保護(hù)作用。發(fā)現(xiàn)肝臟缺血-再灌注的過程中,肝脂肪性變的小鼠與正常的小鼠相比alt和ast在血清中水平更高。硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(thiobarbituric-acid-reactivesubstances,tbars)含量在脂肪肝小鼠肝組織中中也顯著提高,ala+fe2+給藥以后alt和ast還有肝勻漿中tbars含量顯著降低。肝脂肪變性缺血-再灌注損傷比單純性的脂肪肝產(chǎn)生更多的凋亡肝細(xì)胞,主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞凋亡早期過程中細(xì)胞核dna斷裂(tdt-mediateddutpnickendlabeling,tunel)的陽性細(xì)胞的數(shù)量增加,ala+fe2+保護(hù)肝脂肪變性的缺血-再灌注組凋亡的肝細(xì)胞明顯減少。脂肪肝的缺血再灌注組較單純性的脂肪肝組顯著增加f4/80陽性細(xì)胞數(shù)量,而經(jīng)ala+fe2+干預(yù)的脂肪肝缺血再灌注組f4/80陽性細(xì)胞顯著減少。rtpcr提示炎癥因子、il-6、inos,opn,inf-"、tnf-!等在缺血再灌注后mrna表達(dá)顯著升高,ala+fe2+保護(hù)后,mrna水平均明顯降低。脂肪肝缺血再灌注的血紅素氧合酶(hemeoxygenase-1,ho-1)mrna水平在ala+fe2+給藥后較未給藥組顯著升高。同時(shí)檢測肝臟組織一氧化碳(co)濃度顯示,灌服ala+fe2+后,30分鐘到1小時(shí)之間co濃度達(dá)到最高值,此時(shí)正是發(fā)生缺血后再灌注損傷的時(shí)間范圍,綜上所述ala+fe2+對非酒精性脂肪肝的保護(hù)機(jī)理包括降低活性氧含量、抑制肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的凋亡、減少kupffer細(xì)胞激活、抑制炎性因子的表達(dá)以及增強(qiáng)HO-1的表達(dá),在肝臟中產(chǎn)生更多的CO從而達(dá)到減少缺血再灌注對肝臟的損傷。實(shí)驗(yàn)四:體外培養(yǎng)巨噬細(xì)胞系(RAW 264.7)驗(yàn)證ALA+Fe2+在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的炎性環(huán)境中的保護(hù)作用和機(jī)制。實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果表明在加入ALA+Fe2+的培養(yǎng)液中RAW264細(xì)胞在有LPS刺激和沒有LPS刺激時(shí),其OH-1 m RNA的表達(dá)水平均較未添加組顯著升高,而且6小時(shí)組高于3小時(shí)組和陰性對照組。炎性因子如TNF-!、TGF-#等mRNA表達(dá)水平在LPS刺激3小時(shí),6小時(shí)后較陰性對照組顯著升高,在加入ALA+Fe2+的實(shí)驗(yàn)組,3小時(shí),6小時(shí)后的表達(dá)顯著降低。推斷ALA+Fe2+可能通過增強(qiáng)HO-1表達(dá)緩解LPS刺激巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。其結(jié)果與實(shí)驗(yàn)三MCDHF小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.5

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