本文關鍵詞：熊果酸對NADPH氧化酶亞基在靜止型肝星狀細胞活化過程中表達及功能的影響

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【摘要】：背景:肝纖維化由各種慢性肝損傷引起的肝臟過度修復反應造成,主要以I型膠原為主的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)在肝臟內過度沉積為特征�；罨母涡菭罴毎�(hepatic stellate cells,HSCs)是ECM的主要來源,所以靜止型HSC向活化型HSC激活、轉化的過程是肝纖維化的中心事件。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase,NOX)及其產生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)誘導的氧化應激被證實在HSC的激活、轉化及肝纖維化發(fā)病及進展中具有十分重要的作用。我們前期研發(fā)現(xiàn)中藥單體熊果酸能夠顯著抑制細胞因子瘦素、AngII及PDGF誘導的活化型HSCs內NOX亞基的表達、NOX活性、NOX來源的ROS產生及其NOX下游PI3K/Akt、p38MAPK信號通路的激活,從而抑制活化型HSCs的增殖、并誘導其凋亡,發(fā)揮抗肝纖維化作用。那么熊果酸干預是否也能夠通過下調NOX的表達而抑制靜止型HSC的活化,早期預防肝纖維化的發(fā)生,目前尚未闡明。本課題將繼續(xù)在前期研究的基礎上,以健康大鼠原代靜止型肝星狀細胞為研究對象,以TGF-β為促HSC活化因子,探討熊果酸對靜止型HSC活化過程中NOX亞基表達的影響及該影響與靜止型HSC激活、轉化之間的關系,進一步探討熊果酸抗肝纖維化的作用機制。目的:探討熊果酸對大鼠靜止型HSC活化過程中NOX亞基表達的影響,及該影響與靜止型HSC激活、轉化之間的關系。方法:采用肝臟原位灌注及密度梯度離心法從健康SD大鼠體內分離提取原代靜止型HSCs,待原代HSCs自然培養(yǎng)至第5天時將細胞隨機分成五組并加用不同藥物進行處理:空白對照組(control組,細胞自然培養(yǎng)活化),熊果酸組(UA組,40μM),TGF-β組(5μg/L),熊果酸干預組(UA+TGF-β組,UA 40μM+TGF-β5μg/L),DPI干預組(DPI+TGF-Β組,DPI 10μM+TGF-β5μg/L)。原代HSCs經加藥處理24h后提取細胞總蛋白,Western blot檢測NOX亞基gp91phox、p22phox、p67phox及HSC活化特異性標志物α-SMA的蛋白表達水平。藥物作用12h后采用rt-qpcr檢測nox亞基rac1、p22phox及i型膠原的mrna表達。結果:1熊果酸對靜止型hsc活化過程中nox亞基蛋白表達的影響1.1熊果酸對靜止型hsc活化過程中gp91phox蛋白表達的影響tgf-β刺激原代hscs24h后gp91phox蛋白水平明顯高于空白對照組(p0.01);熊果酸組nox亞基gp91phox蛋白表達明顯低于空白對照組(p0.05);在tgf-β刺激原代hscs之前加入熊果酸進行干預后gp91phox蛋白水平較單純tgf-β刺激組顯著降低(p0.01),并且與nox抑制劑dpi干預組相比gp91phox蛋白的表達無統(tǒng)計學差異(p0.05)。上述實驗結果表明,靜止型hsc活化過程中gp91phox蛋白表達明顯升高,而熊果酸干預能夠抑制靜止型hsc活化過程中nox亞基gp91phox的蛋白表達。1.2熊果酸對靜止型hsc活化過程中p67phox蛋白表達的影響原代hscs經tgf-β刺激24h后nox亞基p67phox蛋白表達顯著高于空白對照組(p0.01);熊果酸組p67phox蛋白表達則明顯低于空白對照組(p0.05);用tgf-β刺激原代hscs之前加入熊果酸進行干預后p67phox蛋白水平較單純tgf-β刺激組顯著降低(p0.01),其與nox抑制劑dpi干預組相比p67phox蛋白的表達無統(tǒng)計學差異(p0.05)。上述結果表明,靜止型hsc活化過程中p67phox蛋白表達明顯升高,而熊果酸干預能夠有效抑制靜止型hsc活化過程中nox亞基p67phox的蛋白表達。1.3熊果酸對靜止型hsc活化過程中p22phox蛋白表達的影響tgf-β刺激原代hscs24h后細胞內p22phox的蛋白表達明顯高于空白對照組(p0.01);熊果酸組p22phox蛋白表達明顯低于空白對照組(p0.05);tgf-β作用于原代hscs前使用熊果酸干預使細胞內p22phox蛋白水平較單純tgf-β刺激組均顯著降低(p0.01),且與dpi干預組相比無明顯統(tǒng)計學差異(p0.05)。上述結果表明,靜止型hsc活化過程中p22phox蛋白表達水平明顯升高,而熊果酸干預能夠有效抑制靜止型hsc活化過程中nox亞基p22phox的蛋白表達。2.熊果酸對靜止型hsc活化過程中nox亞基mrna表達的影響2.1熊果酸對靜止型hsc活化過程中rac1mrna表達的影響用tgf-β刺激原代hscs12h后細胞內rac1mrna表達明顯高于空白對照組(p0.01);熊果酸組原代hscs內rac1mrna表達則顯著低于空白對照組(p0.05);在tgf-β刺激原代hscs前分別給予熊果酸、dpi干預后rac1mrna表達較單純tgf-β組均明顯降低(均p0.05),且該兩組間rac1mrna表達統(tǒng)計學差異不明顯(p0.05)。上述結果表明,靜止型hsc活化過程中rac1mrna表達水平明顯升高,而熊果酸干預能夠有效抑制靜止型hsc活化過程中nox亞基rac1的mrna表達。2.2熊果酸對靜止型hsc活化過程中p22phoxmrna表達的影響tgf-β刺激組原代hscs內p22phoxmrna表達明顯高于空白對照組(p0.01);熊果酸組p22phoxmrna表達則明顯低于空白對照組(p0.01);在tgf-β刺激前給予熊果酸干預p22phoxmrna表達較單純tgf-β組明顯降低(p0.01),且其效果與nox抑制劑dpi干預組無明顯差異(p0.05)。上述結果表明,靜止型hsc活化過程中p22phoxmrna表達水平明顯升高,而熊果酸干預能夠有效抑制靜止型hsc活化過程中nox亞基p22phox的mrna表達。3.熊果酸對靜止型hsc活化過程中α-sma蛋白表達的影響原代hscs經tgf-β刺激24h后α-sma蛋白表達明高于空白對照組(p0.05);熊果酸作用于自然培養(yǎng)的原代hscs后α-sma蛋白表達水平較空白對照組明顯降低(p0.05);在tgf-β刺激前分別使用熊果酸、nox抑制劑dpi進行干預后α-sma蛋白的表達較單純tgf-β刺激組均顯著下降(均p0.01),較空白對照也均明顯下降(均p0.05),且兩組間α-sma的表達無明顯統(tǒng)計學差異(p0.05)。上述結果表明,nox參與誘導hsc的活化,熊果酸干預能夠有效降低靜止型hsc活化過程中α-sma的蛋白表達,抑制靜止型hsc的活化。4.熊果酸對靜止型hsc活化過程中i型膠原mrna表達的影響tgf-β刺激原代hscs12h后i型膠原mrna表達則明顯高于空白對照組(p0.05);熊果酸組i型膠原mrna表達明顯低于空白對照組(p0.05);在tgf-β刺激前分別給予熊果酸、dpi干預后i型膠原mrna表達較單純tgf-β刺激組均明顯降低(均p0.01),兩組間i型膠原mrna表達無明顯差異(p0.05)。上述結果表明,nox參與調控hsc合成i型膠原,熊果酸干預能夠有效降低靜止型hsc活化過程中i型膠原的mrna表達。結論:1.在靜止型hsc活化過程中nox亞基gp91phox、p67phox、p22phox、rac1的蛋白及mrna表達明顯升高,熊果酸干預能夠抑制nox亞基的表達上調。2.nox參與調控靜止型hsc的活化及hsc內膠原合成,熊果酸干預能有效抑制靜止型hsc活化及hsc內膠原合成,其機制可能與熊果酸抑制hsc活化過程中NOX亞基的表達有關。
【學位授予單位】：南昌大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：1211173