本文關(guān)鍵詞：熊果酸對(duì)NADPH氧化酶亞基在靜止型肝星狀細(xì)胞活化過程中表達(dá)及功能的影響

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【摘要】：背景:肝纖維化由各種慢性肝損傷引起的肝臟過度修復(fù)反應(yīng)造成,主要以I型膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在肝臟內(nèi)過度沉積為特征�；罨母涡菭罴�(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)是ECM的主要來(lái)源,所以靜止型HSC向活化型HSC激活、轉(zhuǎn)化的過程是肝纖維化的中心事件。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase,NOX)及其產(chǎn)生的活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激被證實(shí)在HSC的激活、轉(zhuǎn)化及肝纖維化發(fā)病及進(jìn)展中具有十分重要的作用。我們前期研發(fā)現(xiàn)中藥單體熊果酸能夠顯著抑制細(xì)胞因子瘦素、AngII及PDGF誘導(dǎo)的活化型HSCs內(nèi)NOX亞基的表達(dá)、NOX活性、NOX來(lái)源的ROS產(chǎn)生及其NOX下游PI3K/Akt、p38MAPK信號(hào)通路的激活,從而抑制活化型HSCs的增殖、并誘導(dǎo)其凋亡,發(fā)揮抗肝纖維化作用。那么熊果酸干預(yù)是否也能夠通過下調(diào)NOX的表達(dá)而抑制靜止型HSC的活化,早期預(yù)防肝纖維化的發(fā)生,目前尚未闡明。本課題將繼續(xù)在前期研究的基礎(chǔ)上,以健康大鼠原代靜止型肝星狀細(xì)胞為研究對(duì)象,以TGF-β為促HSC活化因子,探討熊果酸對(duì)靜止型HSC活化過程中NOX亞基表達(dá)的影響及該影響與靜止型HSC激活、轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系,進(jìn)一步探討熊果酸抗肝纖維化的作用機(jī)制。目的:探討熊果酸對(duì)大鼠靜止型HSC活化過程中NOX亞基表達(dá)的影響,及該影響與靜止型HSC激活、轉(zhuǎn)化之間的關(guān)系。方法:采用肝臟原位灌注及密度梯度離心法從健康SD大鼠體內(nèi)分離提取原代靜止型HSCs,待原代HSCs自然培養(yǎng)至第5天時(shí)將細(xì)胞隨機(jī)分成五組并加用不同藥物進(jìn)行處理:空白對(duì)照組(control組,細(xì)胞自然培養(yǎng)活化),熊果酸組(UA組,40μM),TGF-β組(5μg/L),熊果酸干預(yù)組(UA+TGF-β組,UA 40μM+TGF-β5μg/L),DPI干預(yù)組(DPI+TGF-Β組,DPI 10μM+TGF-β5μg/L)。原代HSCs經(jīng)加藥處理24h后提取細(xì)胞總蛋白,Western blot檢測(cè)NOX亞基gp91phox、p22phox、p67phox及HSC活化特異性標(biāo)志物α-SMA的蛋白表達(dá)水平。藥物作用12h后采用rt-qpcr檢測(cè)nox亞基rac1、p22phox及i型膠原的mrna表達(dá)。結(jié)果:1熊果酸對(duì)靜止型hsc活化過程中nox亞基蛋白表達(dá)的影響1.1熊果酸對(duì)靜止型hsc活化過程中g(shù)p91phox蛋白表達(dá)的影響tgf-β刺激原代hscs24h后gp91phox蛋白水平明顯高于空白對(duì)照組(p0.01);熊果酸組nox亞基gp91phox蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(p0.05);在tgf-β刺激原代hscs之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后gp91phox蛋白水平較單純tgf-β刺激組顯著降低(p0.01),并且與nox抑制劑dpi干預(yù)組相比gp91phox蛋白的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,靜止型hsc活化過程中g(shù)p91phox蛋白表達(dá)明顯升高,而熊果酸干預(yù)能夠抑制靜止型hsc活化過程中nox亞基gp91phox的蛋白表達(dá)。1.2熊果酸對(duì)靜止型hsc活化過程中p67phox蛋白表達(dá)的影響原代hscs經(jīng)tgf-β刺激24h后nox亞基p67phox蛋白表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組(p0.01);熊果酸組p67phox蛋白表達(dá)則明顯低于空白對(duì)照組(p0.05);用tgf-β刺激原代hscs之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后p67phox蛋白水平較單純tgf-β刺激組顯著降低(p0.01),其與nox抑制劑dpi干預(yù)組相比p67phox蛋白的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。上述結(jié)果表明,靜止型hsc活化過程中p67phox蛋白表達(dá)明顯升高,而熊果酸干預(yù)能夠有效抑制靜止型hsc活化過程中nox亞基p67phox的蛋白表達(dá)。1.3熊果酸對(duì)靜止型hsc活化過程中p22phox蛋白表達(dá)的影響tgf-β刺激原代hscs24h后細(xì)胞內(nèi)p22phox的蛋白表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(p0.01);熊果酸組p22phox蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(p0.05);tgf-β作用于原代hscs前使用熊果酸干預(yù)使細(xì)胞內(nèi)p22phox蛋白水平較單純tgf-β刺激組均顯著降低(p0.01),且與dpi干預(yù)組相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。上述結(jié)果表明,靜止型hsc活化過程中p22phox蛋白表達(dá)水平明顯升高,而熊果酸干預(yù)能夠有效抑制靜止型hsc活化過程中nox亞基p22phox的蛋白表達(dá)。2.熊果酸對(duì)靜止型hsc活化過程中nox亞基mrna表達(dá)的影響2.1熊果酸對(duì)靜止型hsc活化過程中rac1mrna表達(dá)的影響用tgf-β刺激原代hscs12h后細(xì)胞內(nèi)rac1mrna表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(p0.01);熊果酸組原代hscs內(nèi)rac1mrna表達(dá)則顯著低于空白對(duì)照組(p0.05);在tgf-β刺激原代hscs前分別給予熊果酸、dpi干預(yù)后rac1mrna表達(dá)較單純tgf-β組均明顯降低(均p0.05),且該兩組間rac1mrna表達(dá)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異不明顯(p0.05)。上述結(jié)果表明,靜止型hsc活化過程中rac1mrna表達(dá)水平明顯升高,而熊果酸干預(yù)能夠有效抑制靜止型hsc活化過程中nox亞基rac1的mrna表達(dá)。2.2熊果酸對(duì)靜止型hsc活化過程中p22phoxmrna表達(dá)的影響tgf-β刺激組原代hscs內(nèi)p22phoxmrna表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組(p0.01);熊果酸組p22phoxmrna表達(dá)則明顯低于空白對(duì)照組(p0.01);在tgf-β刺激前給予熊果酸干預(yù)p22phoxmrna表達(dá)較單純tgf-β組明顯降低(p0.01),且其效果與nox抑制劑dpi干預(yù)組無(wú)明顯差異(p0.05)。上述結(jié)果表明,靜止型hsc活化過程中p22phoxmrna表達(dá)水平明顯升高,而熊果酸干預(yù)能夠有效抑制靜止型hsc活化過程中nox亞基p22phox的mrna表達(dá)。3.熊果酸對(duì)靜止型hsc活化過程中α-sma蛋白表達(dá)的影響原代hscs經(jīng)tgf-β刺激24h后α-sma蛋白表達(dá)明高于空白對(duì)照組(p0.05);熊果酸作用于自然培養(yǎng)的原代hscs后α-sma蛋白表達(dá)水平較空白對(duì)照組明顯降低(p0.05);在tgf-β刺激前分別使用熊果酸、nox抑制劑dpi進(jìn)行干預(yù)后α-sma蛋白的表達(dá)較單純tgf-β刺激組均顯著下降(均p0.01),較空白對(duì)照也均明顯下降(均p0.05),且兩組間α-sma的表達(dá)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。上述結(jié)果表明,nox參與誘導(dǎo)hsc的活化,熊果酸干預(yù)能夠有效降低靜止型hsc活化過程中α-sma的蛋白表達(dá),抑制靜止型hsc的活化。4.熊果酸對(duì)靜止型hsc活化過程中i型膠原mrna表達(dá)的影響tgf-β刺激原代hscs12h后i型膠原mrna表達(dá)則明顯高于空白對(duì)照組(p0.05);熊果酸組i型膠原mrna表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(p0.05);在tgf-β刺激前分別給予熊果酸、dpi干預(yù)后i型膠原mrna表達(dá)較單純tgf-β刺激組均明顯降低(均p0.01),兩組間i型膠原mrna表達(dá)無(wú)明顯差異(p0.05)。上述結(jié)果表明,nox參與調(diào)控hsc合成i型膠原,熊果酸干預(yù)能夠有效降低靜止型hsc活化過程中i型膠原的mrna表達(dá)。結(jié)論:1.在靜止型hsc活化過程中nox亞基gp91phox、p67phox、p22phox、rac1的蛋白及mrna表達(dá)明顯升高,熊果酸干預(yù)能夠抑制nox亞基的表達(dá)上調(diào)。2.nox參與調(diào)控靜止型hsc的活化及hsc內(nèi)膠原合成,熊果酸干預(yù)能有效抑制靜止型hsc活化及hsc內(nèi)膠原合成,其機(jī)制可能與熊果酸抑制hsc活化過程中NOX亞基的表達(dá)有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

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本文編號(hào)：1211173