本文關鍵詞：CD24在小鼠急性肝損傷中對巨噬細胞的調節(jié)作用及其分子機制

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【摘要】：研究目的與內容:本研究旨在探究CD24分子在刀豆蛋白A(Concanavalin A,Con A)誘導小鼠急性肝損傷的模型中對肝內巨噬細胞的調節(jié)作用及其可能的分子機制。實驗包括以下三個方面:一、建立Con A誘導的小鼠急性肝損傷模型,觀察CD24分子在小鼠急性肝損傷中的作用。二、檢測CD24分子在肝臟固有免疫細胞的表達,觀察CD24分子對肝內巨噬細胞的調節(jié)作用。三、分析急性肝損傷過程中肝臟巨噬細胞的來源及功能變化,探究CD24分子調節(jié)肝內巨噬細胞的分子機制。研究方法和結果:本課題實驗共分三部分進行:第一部分觀察CD24分子對Con A誘導小鼠急性肝損傷的作用,包括以下三個實驗:1.分別以不同濃度和時間點的Con A刺激小鼠,觀察小鼠解剖學上的改變,HE染色觀察小鼠肝臟損傷程度,血清學方法檢測小鼠肝功能指標谷丙轉氨酶(ALT)水平的變化,建立Con A誘導的小鼠急性肝損傷模型。結果表明:Con A誘導的小鼠急性肝損傷有時間和劑量依賴性,當尾靜脈注射10mg/kg小鼠9h后,小鼠肝組織腫大,肝臟充血嚴重,且血清的ALT水平顯著升高。2.觀察anti-CD24中和抗體(200μg/mouse)和10mg/kg Con A聯(lián)合注射組小鼠肝臟解剖學上的改變;HE染色觀察小鼠肝組織病理改變;血清學方法檢測小鼠肝功能指標ALT水平的變化。結果表明:anti-CD24中和抗體導致小鼠的肝組織腫大;且出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤和肝細胞壞死;小鼠的血清ALT水平顯著升高。3.觀察CD24-/-基因敲除小鼠注射Con A后肝臟解剖學上的改變;HE染色觀察小鼠肝組織病理改變;血清學方法檢測小鼠肝功能指標ALT水平的變化。結果表明:CD24-/-基因敲除的小鼠炎癥反應顯著高于WT小鼠,且出現(xiàn)明顯的炎性細胞浸潤和肝細胞壞死,小鼠的血清ALT水平顯著升高。第二部分觀察cd24分子對小鼠肝臟巨噬細胞的調節(jié)作用,包括以下三個實驗:1.流式細胞術檢測小鼠肝損傷后cd24分子的表達變化及其在肝內不同免疫細胞的表達量。結果表明:cona誘導小鼠急性肝損傷后,小鼠肝組織細胞cd24分子表達顯著降低。在肝臟天然免疫細胞中,cd24分子在肝內巨噬細胞的表達量最高。2.注射氯氟松(clophosome)消耗小鼠肝臟巨噬細胞,觀察小鼠肝損傷后解剖學上的改變,he染色觀察小鼠肝臟損傷程度,血清學方法檢測小鼠alt水平的變化。結果表明:氯氟松消耗小鼠肝臟巨噬細胞后,小鼠的炎癥反應顯著下降,肝臟充血減輕,炎性細胞浸潤減輕,無壞死出現(xiàn),血清alt水平顯著下降。且小鼠的m1型和m2型巨噬細胞均顯著下降。3.流式細胞術檢測不同時間點cona刺激小鼠急性肝損傷后肝內巨噬細胞亞型的改變,anti-cd24中和抗體對肝臟巨噬細胞亞型分布的影響。檢測cd24-/-基因敲除小鼠和wt小鼠急性肝損傷后巨噬細胞亞型分布的改變。檢測注射氯氟松消耗小鼠巨噬細胞后,巨噬細胞亞型的改變。結果表明:cona刺激3h-9h,m1型巨噬細胞的頻率顯著增加。anti-cd24中和抗體顯著增加m1型巨噬細胞的頻率,而m2型巨噬細胞的頻率變化不明顯。cd24-/-基因敲除小鼠的m1型巨噬細胞的頻率顯著高于wt小鼠,m2型巨噬細胞變化不明顯。注射氯氟松后,小鼠的m1型和m2型巨噬細胞均顯著下降,且cd24-/-基因敲除小鼠的m1型巨噬細胞比例高于wt鼠。第三部分探究cd24分子調節(jié)肝內巨噬細胞的分子機制,包括以下三個實驗:1.realtimepcr檢測不同組小鼠肝臟組織和細胞水平m1型巨噬細胞標志物的mrna表達情況,流式細胞術檢測m1型巨噬細胞的來源和增殖方式。結果表明:注射cona后,小鼠肝臟組織水平和體外刺激巨噬細胞水平m1型巨噬細胞標志物的mrna表達均顯著上升,m1型巨噬細胞主要為單核細胞來源,也有極小部分通過肝內的自我更新來實現(xiàn)。2.realtimepcr檢測不同基因背景小鼠肝臟tnf-α、il-1β、il-6、il-10、il-12等炎癥因子及ccr1、ccr2、ccr5等趨化因子mrna的表達情況。結果表明:cona刺激后,cd24-/-基因敲除小鼠肝臟的炎癥因子mrna表達均顯著高于wt小鼠。ccr2趨化因子mrna表達顯著高于wt小鼠。3.Real time PCR檢測注射氯氟松后,肝臟組織表達腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的變化,肝臟巨噬細胞表達TNF-α的變化。胞內染色流式細胞術檢測不同組小鼠肝臟M1型巨噬細胞分泌TNF-α的變化,流式細胞術檢測TNF-α誘導的肝細胞的凋亡率。結果表明:注射氯氟松后,小鼠肝臟組織的TNF-αmRNA表達顯著下降。Anti-CD24中和抗體和CD24-/-基因敲除小鼠的M1型巨噬細胞細胞分泌的TNF-α均顯著高于WT對照組小鼠。聯(lián)合刺激組小鼠和CD24-/-基因敲除小鼠的肝細胞早期和晚期凋亡率均顯著高于WT對照組小鼠。結論:1.Con A誘導的小鼠急性肝損傷具有時間和劑量依賴性,CD24分子可以保護Con A誘導的小鼠急性肝損傷。2.CD24分子對肝內巨噬細胞亞型具有調節(jié)作用,通過抑制M1型巨噬細胞的表達來保護Con A誘導的小鼠急性肝損傷。3.肝內M1亞型巨噬細胞主要來源于單核細胞,極少量來源于肝內的自我增殖和更新,CD24分子可以降低單核細胞來源的M1型巨噬細胞。4.CD24分子通過抑制M1型巨噬細胞分泌TNF-α,進而抑制肝細胞的凋亡,來保護Con A誘導的小鼠急性肝損傷。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575

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