本文關鍵詞：IL-17A在結腸炎相關結直腸癌變中的作用與機制研究

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【摘要】：結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是消化系統常見惡性腫瘤之一,是整個世界范圍內造成死亡的主要疾病之一,在歐美國家分別位列第一、二位,發(fā)病率呈逐年增長趨勢。據美國癌癥協會估計,2014年美國新發(fā)CRC病例136 830例,死亡50 310例。近年來,我國結直腸癌特別是直腸癌(占60%)的發(fā)病率和病死率也呈不斷上升趨勢,CRC的發(fā)病率在我國城市和農村分別占惡性腫瘤發(fā)病率的第四位和第六位,嚴重威脅國民的身心健康。潰瘍性結腸炎相關結直腸癌是潰瘍性結腸炎(Ulcerative colitis,UC)的嚴重并發(fā)癥,雖然只占所有CRC的1%~2%,但死亡率卻占UC患者的10%~15%。結直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因素、多階段的過程。研究表明某些因素能夠增加患結直腸癌的風險,如年齡、結直腸息肉、潰瘍性結腸炎和克羅恩病、結直腸癌家族史、種族、2型糖尿病等,家族性腺瘤息肉病(familial adenomatous polyposis,FAP)或遺傳性非息肉病性大腸癌(hereditary nonpolyposis colon cancer,HNPCC)等家庭綜合癥。一些生活習慣因素也與高結腸直腸癌的風險有關,如膳食中含大量紅肉類(牛肉、羊肉、或肝臟)、加工肉類(如熱狗和博洛尼亞)及高熱量食品,缺乏鍛煉、超重和肥胖、吸煙、酗酒等。眾所周知,炎癥性腸病(Inflammatory bowel diseases,IBD),包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病,有發(fā)展成為結直腸癌的風險,目前普遍認為,IBD是攜帶遺傳易感基因的宿主在環(huán)境因素參與下,由于慢性腸道感染、黏膜抗原屏障缺陷以及腸腔內抗原物質的異常免疫反應所導致。長期UC患者發(fā)生癌變的危險性升高,UC并發(fā)結直腸癌癌變可能與其慢性炎癥長期作用相關,其發(fā)生發(fā)展經歷著從正常上皮組織、低度異型增生、高度異型增生到癌變的過程,但目前具體機制仍不明,多方面因素改變均可能在癌變過程中發(fā)揮重要作用。白細胞介素17(Interleukin-17,IL-17)是體內重要的促炎癥細胞因子,由155~197個氨基酸構成,分子量約為20~30kDa,主要由活化的T淋巴細胞分泌,包括CD4+CD45RO+T細胞、CD8+T細胞、γδT細胞等,其中,cd4+t細胞亞群中th17細胞是il-17的主要來源細胞,但最近研究發(fā)現上皮細胞、血管內皮細胞以及某些腫瘤細胞均可產生il-17。il-17家族以同源或異源二聚體的形式行使功能,il-17與il-17ra/il-17rc異源二聚體形成復合體,通過類似于纖維母細胞因子的表達方式,激活核因子-κb(nf-κb)激活劑1(nuclearfactor-κbactivator1,act1)、il-17受體和toll-il-1r(sefir)受體結構域。act1是一種e3泛素連接酶,通過ubc13/uev1ae2復合物,以k63多聚泛素化的方式在k124位修飾腫瘤壞死因子受體相關因子6(tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor6,traf6),介導il-17下游信號傳遞及炎癥基因表達。多聚泛素化的traf6激活轉化生長因子β活化激酶1(transforminggrowthfactor-β-activatedkinase1,tak1)和iκb激酶(iκbkinase,ikk)復合物,后者激活nf-κb信號通路,啟動包括cxcl1、il-6、vegf等的一系列化學因子、細胞因子和生長因子的轉錄。il-17只能微弱激活下游信號及基因表達,但il-17可以調控mrna穩(wěn)定性,以此協同其他細胞因子,從而放大靶細胞對il-17的反應。il-17能夠通過ikki激酶依賴的act1-traf2-traf5復合體,增加下游cxcl1mrna穩(wěn)定性,act1-traf2-traf5復合體與剪接子2(splicingfactor2,sf2)綁定,阻止sf2/asf介導的mrna降解。目前,il-17在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用尚存在爭議,利用動物模型,一些研究發(fā)現il-17a可以通過ifn-γ生產nk細胞和t細胞,抑制腫瘤的生長和轉移,而另有研究表明,il-17a能夠通過il-6/stat3信號途徑或通過誘導腫瘤局部微環(huán)境改變,促進腫瘤的生長和轉移。本研究旨在探討il-17a在結腸炎相關結直腸癌發(fā)生中的作用,并對其機制進行初步探討,為治療結腸炎相關結直腸癌提供理論依據。第一部分人結腸組織癌變與il-17a誘導的炎癥反應增強有關目的:探討il-17a誘導的炎癥反應在人結腸癌中的作用。方法:通過elisa方法檢測結腸組織中il-17a細胞因子濃度,westernblot方法檢測il-17/il-17r、vegf、mmp2、mmp7、mmp9、erk、p-erk、jnk、p-jnk蛋白,免疫組織化學染色方法檢測il-17、mmp2蛋白在結腸組織中的定位,利用cd34染色檢測結腸組織中微血管密度。結果:il-17a和il-17ra蛋白均為結直腸癌組織中最高,明顯高于腺瘤、潰瘍性結腸炎及正常結腸組織。伴隨il-17a和il-17ra增加,il-17a誘導的炎癥反應增強,包括細胞外信號轉導信號erk1/2和jnk激活、基質金屬蛋白酶mmp9、mmp7和mmp2、bcl-2和cyclind1表達增加,bax表達減少。結直腸癌組織中vegf和vegfr表達最高,其次為腺瘤組織,而在潰瘍性結腸炎組織和正常結腸組織中的vegf蛋白幾乎檢測不到。第二部分il-17a對hct116細胞遷移侵襲能力的影響目的:探討il-17a對結直腸癌細胞侵襲轉移能力的影響。方法:體外培養(yǎng)hct116細胞,經過不同的處理(空白對照組、il-17a處理組、pd98059+il-17a組、sp600125+il-17a組),分別采用劃痕實驗和transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力,westernblot方法檢測il-17ra、erk、p-erk、jnk、p-jnk、mmp2、mmp7、mmp9、cyclind1、bcl-2、bax、vegf、vegfr蛋白表達。結果:臺盼藍染色及細胞藍?檢測均顯示il-17a處理的hct116細胞增殖活性高于對照組,而pd98059和sp600125預處理組細胞增殖活性顯著下降;對照組、il-17a組、pd98059和sp600125預處理組transwell穿膜細胞數為9.5±1.06、15.4±1.11、3.7±0.53和4.3±0.55,除后2組之間差異無統計學意義外,其余各組間差異均有統計學意義;il-17a組hct116細胞遷移能力最強,劃痕變窄,而pd98059和sp600125預處理組細胞遷移能力下降,劃痕距離未見明顯變化;il-17a增加hct116細胞il-17ra、mmp2、mmp7、mmp9、cyclind1、bcl-2、vegf、vegfr蛋白分泌,使erk1/2、jnk磷酸化增加,給予pd98059和sp600125預處理,上述蛋白表達減少。第三部分il-17asirna對結腸炎相關結直腸癌模型小鼠的治療作用目的:探討il-17asirna對結腸炎相關結直腸癌模型小鼠的治療作用。方法:采用偶氮氧化甲烷/葡聚糖硫酸鈉方法建立潰瘍性結腸炎相關結直腸癌小鼠模型,建模成功后給予il-17asirna干擾治療,實驗分為對照組、模型組和il-17asirna治療組,real-timepcr檢測各組結腸組織il-17a、il-17ramrna水平,westernblot檢測il-17a、il-17ra、erk、p-erk、jnk、p-jnk、mmp2、mmp7、mmp9、cyclind1、bcl-2、bax、VEGF、VEGFR蛋白表達。結果:IL-17A si RNA治療組小鼠體重較模型組增加,粘膜上皮損傷及腺體結構的消失程度均較模型組減輕;IL-17A和IL-17RA基因和蛋白均為模型組最高,IL-17A siRNA治療組次之,對照組最低(P0.05);IL-17A siRNA治療組p-ERK1/2、p-JNK蛋白低于模型組;模型組、IL-17A siRNA治療組、對照組結腸組織中MMP2、MMP7、MMP9、Bcl-2、Cyclin D1、VEGF、VEGFR蛋白表達依次降低,而Bax則為對照組最高,模型組最低。結論:1結直腸癌組織中IL-17A表達增高。2 IL-17A可能通過ERK1/2和JNK1/2信號通路調控下游信號蛋白表達,在結直腸癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。3 IL-17A siRNA治療能夠抑制結直腸癌進展,可能成為結直腸癌預防和治療新靶點。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R574.62;R735.3

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