發(fā)布時間：2017-11-14 22:21

  本文關(guān)鍵詞：非酒精性脂肪肝斑馬魚模型的建立及依替米貝、辛伐他汀對非酒精性脂肪肝的療效性研究

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【摘要】：研究背景非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是除外酒精及其他明確肝損害因素所致的肝細胞內(nèi)甘油三酯蓄積為主要特征的臨床綜合癥。NAFLD的疾病譜包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis, NASH)、非酒精性脂肪性纖維化和非酒精性脂肪性肝硬化四種主要類型。NAFLD通常合并肥胖和(或)2型糖尿病、高脂血癥及其相關(guān)的心腦血管疾病,也與肝硬化、原發(fā)性肝癌和肝功能衰竭的發(fā)病有著密切關(guān)聯(lián)。隨著社會的經(jīng)濟發(fā)展,NAFLD已成為我國繼病毒性肝炎之后第二大慢性肝病,嚴重危害我國人民的生命健康。在NAFLD研究中困擾我們的主要問題是：1.發(fā)病機制問題：NAFLD的發(fā)病機制錯綜復(fù)雜,目前仍未完全闡明。迄今為止,最成熟的假說是Day等提出的的“二次打擊”學(xué)說。初次打擊是指由胰島素抵抗等因素引起的肝內(nèi)甘油三酯和游離脂肪酸蓄積；脂肪化的肝細胞對內(nèi)、外源性有害因子刺激更為敏感,出現(xiàn)氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化、細胞因子的釋放和Fas配體的誘導(dǎo)活化,引起肝細胞炎癥、壞死,即為第二次打擊�！岸未驌簟睂W(xué)說雖提出了基本的概念,但并不足以揭示NAFLD發(fā)生發(fā)展的全貌；2.藥物治療問題：NAFLD的治療提倡改變生活方式、去除病因誘因等基礎(chǔ)治療,必要時予以保肝、抗炎、抗纖維化類藥物輔助治療。然而,目前臨床上仍缺少有效的特效藥物,對于NAFLD的新藥開發(fā)具有重要的現(xiàn)實意義。建立一種經(jīng)濟實用而又簡單易行的動物模型對NAFLD發(fā)病機制和防治藥物開發(fā)具有深遠意義。與嚙齒動物相比,斑馬魚的生理優(yōu)勢體現(xiàn)在：1.體積小,繁殖能力強,易于大規(guī)模飼養(yǎng)；2.發(fā)育迅速、性成熟期短,實驗周期相對較短；3.胚胎透明,器官清晰可見,易于活體觀察病變；4.基因組序列的注釋已全部完成；5.在藥物篩選方面,易于獲得足夠的樣本量,便于大規(guī)模篩選。然而,迄今為止國內(nèi)對于NAFLD的基礎(chǔ)研究還是以嚙齒動物為主,尚未有斑馬魚NAFLD模型的相關(guān)報道。本研究旨在利用斑馬魚獨特的生理結(jié)構(gòu)優(yōu)勢,采用單純高脂或聯(lián)合高膽固醇飼料喂食的方式在國內(nèi)外首次建立一種簡單易行而又經(jīng)濟實用的斑馬魚幼魚NAFLD模型。在模型建立成功的前提下,采用依替米貝、辛伐他汀兩種藥物進行干預(yù),利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段系統(tǒng)評估藥物的療效并驗證模型的穩(wěn)定性。最后,從脂質(zhì)代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥方面探討NAFLD的發(fā)病機制和藥物的作用機制,以期為NAFLD的相關(guān)機制研究和藥物開發(fā)提供新的思路。研究目的1.采用高脂飼料和高脂聯(lián)合高膽固醇飼料喂食的方式建立一種簡單易行、重復(fù)性好的斑馬魚幼魚非酒精性脂肪肝模型。2.觀察依替米貝、辛伐他汀兩種藥物對非酒精性脂肪肝斑馬魚幼魚的影響,包括一般情況(生存率、進食和游動情況),體長和體重測定,生化學(xué)指標(biāo),肝內(nèi)脂質(zhì)沉積情況及肝臟病理等關(guān)鍵指標(biāo),綜合評估依替米貝、辛伐他汀對非酒精性脂肪肝是否具有保護作用。3.研究非酒精性脂肪肝發(fā)病機制和依替米貝、辛伐他汀兩種藥物作用機制,包括對脂質(zhì)代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、炎癥通路相關(guān)基因和蛋白表達水平的影響。研究方法1.實驗動物野生型AB品系斑馬魚由南方醫(yī)科大學(xué)人類疾病斑馬魚模型和藥物篩選重點實驗室提供,按照Westerfield方法對斑馬魚進行養(yǎng)殖。在模型建立時,將發(fā)育正常的幼魚完全隨機分為四組,分別為：正常對照組,高脂組,2.5%高脂高膽固醇組,5.0%高脂高膽固醇組。在藥效觀察時,實驗為四組,分別為：正常對照組,2.5%高脂高膽固醇組(模型組),依替米貝干預(yù)組和辛伐他汀干預(yù)組。參照文獻中藥物的濃度和給藥方式,依替米貝以1μM濃度直接添加到養(yǎng)魚水中,辛伐他汀以50μg/g的濃度添加到飼料中。2.斑馬魚幼魚一般情況觀察每日觀察斑馬魚幼魚生長、進食、活動度和死亡情況。于處理時間點記錄斑馬魚體長并測量體重。3.斑馬魚幼魚整體油紅染色收集各組斑馬魚幼魚于6孔板中,4%多聚甲醛4℃固定過夜,PBS洗滌2次,依次浸入80%、100%丙二醇,每個濃度20分鐘,然后加入新鮮配制的0.5%油紅室溫孵育過夜,注意避光。次日,將染液吸出,PBS洗滌2次,然后100%、80%丙二醇從高濃度到低濃度洗凈背景,每個濃度30分鐘。將染色完成的樣本置于80%丙二醇中,4℃冰箱保存。Olympus szx10體式顯微鏡下觀察肝細胞脂質(zhì)沉積情況并進行拍照,記錄脂肪肝發(fā)生率。4.斑馬魚幼魚冰凍切片和油紅染色收集各組斑馬魚幼魚于1.5m1 EP管中,4%多聚甲醛4℃固定過夜。次日,加入30%蔗糖脫水,4℃脫水過夜。將脫水完全的幼魚用OCT包埋劑包埋,10μm切片,行油紅染色,Olympus BX51光鏡下觀察肝臟脂質(zhì)沉積情況并拍照記錄。5.斑馬魚幼魚組織病理學(xué)切片和蘇木素-伊紅染色收集各組斑馬魚幼魚于1.5ml EP管中,4%多聚甲醛4℃固定過夜。次日,酒精按低濃度到高濃度進行脫水,二甲苯進行透明處理,浸蠟后將組織進行包埋,4μm切片,行蘇木素-伊紅染液染色,Olympus BX51光鏡下觀察肝臟病理變化并拍照記錄。6.斑馬魚幼魚肝組織生化指標(biāo)檢測顯微鏡下剝離每組斑馬魚幼魚肝臟,每組約50-70條。裂解液將組織充分裂解,離心,取上清待測。按照試劑說明書進行操作,檢測幼魚肝組織內(nèi)甘油三酯(Triglyceride, TG)、總膽固醇(Total cholesterol, TC)和游離膽固醇(Free cholesterol, FC)的含量。7. Real-time RT-PCR顯微鏡下剝離每組斑馬魚幼魚肝臟置于1.5ml去RNA酶的EP管中,每組約為20-30條。迅速加入Trizol,總RNA按照步驟提取。RNA的純度和濃度通過紫外分光光度法(Nanodrop, Thermo Fisher Scientific, USA)測定。利用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA.實時定量聚合酶連鎖反應(yīng)采用Light Cycler 480 (Roche, Basel, Switzerland)進行檢測。8. Western-blotting顯微鏡下剝離每組斑馬魚幼魚肝臟置于1.5ml EP管中,每組約20-30條。迅速加入RIPA裂解液,按照步驟提取總蛋白。蛋白濃度通過BCA法測定,酶標(biāo)儀測定各樣本OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本蛋白濃度。將聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,室溫封閉1小時后,一抗4℃孵育過夜。次日,洗滌一抗后孵育二抗,暗室發(fā)光,觀察目的蛋白條帶。9.統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間兩兩比較采用one-way ANOVA。作圖用Graphpad Prism 5 (Graphpad, La Jolla,CA,USA)軟件。P0.05有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。研究結(jié)果第一章非酒精性脂肪肝斑馬魚幼魚模型的建立1.高脂高膽固醇喂食對斑馬魚幼魚生存率的影響喂養(yǎng)到第10天時,對照組、高脂組、2.5%高脂高膽固醇組和5.0%高脂高膽固醇組斑馬魚幼魚生存率分別為96.67±5.79%,88.66±8.59%,90.00±5.93%,94.67±5.89%,各組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。2.高脂高膽固醇喂食對斑馬魚幼魚體長的影響喂養(yǎng)到第7和第10天時,高脂組和兩個不同濃度高脂高膽固醇組斑馬魚幼魚體長顯著長于對照組(P0.01,n=90),而體長在2.5%高脂高膽固醇組和5.0%高脂高膽固醇組之間無顯著差異(P0.05,n=90)。3.高脂高膽固醇喂食對斑馬魚幼魚體重的影響喂養(yǎng)到第7天和第10天時,高脂組和兩個不同濃度高脂高膽固醇組斑馬魚幼魚較對照組體重顯著增加(P0.01,n=90),而體重在2.5%高脂高膽固醇組和5.0%高脂高膽固醇組之間無顯著差異(P0.05,n=90)。4.高脂高膽固醇喂食導(dǎo)致斑馬魚幼魚肝內(nèi)大量脂滴沉積整體油紅染色和冰凍切片油紅染色結(jié)果顯示：與對照組相比,高脂組斑馬魚幼魚肝內(nèi)染色加深。與高脂組相比,高脂高膽固醇組肝內(nèi)染色更為顯著。5.高脂高膽固醇喂食對斑馬魚幼魚脂肪肝發(fā)生率的影響喂食到第7天和第10天時,與對照組相比,高脂組和高脂高膽固醇組斑馬魚幼魚脂肪肝發(fā)生率顯著增高(P0.001,n100)。6.高脂高膽固醇喂食對斑馬魚幼魚肝組織生化指標(biāo)的影響與對照組相比,高脂組和兩個不同濃度高脂高膽固醇組斑馬魚幼魚肝內(nèi)TG、TC、FC水平明顯增高,組間存在顯著差異(P0.05)。與高脂組相比,兩個不同濃度高脂高膽固醇組肝內(nèi)TC、FC水平升高的更為顯著(P0.001)。7.高脂高膽固醇喂食對斑馬魚幼魚肝臟組織病理的影響光鏡下對照組斑馬魚幼魚肝組織形態(tài)學(xué)正常,高脂組和高脂高膽固醇組肝細胞結(jié)構(gòu)異常,脂滴將核擠至一邊,肝內(nèi)可見脂滴。第二章依替米貝、辛伐他汀對非酒精性脂肪肝斑馬魚幼魚的療效性研究1.依替米貝、辛伐他汀對NAFLD幼魚生存率的影響喂養(yǎng)到第10天時,對照組、2.5%高脂高膽固醇組、依替米貝干預(yù)組和辛伐他汀干預(yù)組斑馬魚生存率分別為85.00±5.22%,80.00±4.20%,82.67±5.47%,81.17±5.12%,各組之間均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。2.依替米貝、辛伐他汀對NAFLD幼魚體長的影響喂養(yǎng)到第7天和第10天時,與對照組相比,2.5%高脂高膽固醇組幼魚的體長顯著增長(P=0.000,n=90)。喂養(yǎng)到第7天和第10天時,與2.5%高脂高膽固醇組相比,依替米貝干預(yù)組和辛伐他汀干預(yù)組幼魚體長顯著下降(P0.01,n=90)。3.依替米貝、辛伐他汀對NAFLD幼魚體重的影響喂養(yǎng)到第7天和第10天時,與對照組相比,2.5%高脂高膽固醇組幼魚的體重顯著增長(P=0.000,n=90)。喂養(yǎng)到第7天時,與2.5%高脂高膽固醇組相比,依替米貝干預(yù)組和辛伐他汀干預(yù)組幼魚體長顯著下降(依替米貝干預(yù)組對比2.5%高脂高膽固醇組,P=0.011；辛伐他汀干預(yù)組對比2.5%高脂高膽固醇組,P=0.001)；喂養(yǎng)到第10天時,與2.5%高脂高膽固醇組相比,依替米貝干預(yù)組和辛伐他汀干預(yù)組幼魚體長有所下降,但無統(tǒng)計學(xué)意義(依替米貝干預(yù)組對比2.5%高脂高膽固醇組,P=0.291；辛伐他汀干預(yù)組對比2.5%高脂高膽固醇組,P=0.127)。4.依替米貝、辛伐他汀對NAFLD幼魚肝內(nèi)脂質(zhì)沉積情況的影響整體油紅染色和冰凍切片油紅染色的結(jié)果顯示：與對照組相比,2.5%高脂高膽固醇組幼魚肝臟染色加深,肝內(nèi)脂質(zhì)沉積增多；與2.5%高脂高膽固醇組相比,依替米貝干預(yù)組和辛伐他汀干預(yù)組幼魚肝臟染色明顯減輕,肝臟脂質(zhì)沉積減少；與辛伐他汀干預(yù)組相比,依替米貝干預(yù)組改善幼魚脂肪肝的效果更為顯著。5.依替米貝、辛伐他汀對NAFLD幼魚肝組織生化指標(biāo)的影響與對照組相比,2.5%高脂高膽固醇組幼魚肝內(nèi)TG、TC、FC水平顯著增高(P0.001)。與2.5%高脂高膽固醇組相比,依替米貝干預(yù)組和辛伐他汀干預(yù)組幼魚TG、TC、FC水平均有所下降(依替米貝干預(yù)組對比2.5%高脂高膽固醇組,P0.01；辛伐他汀干預(yù)組對比2.5%高脂高膽固醇組,P0.05)。與辛伐他汀干預(yù)組相比,依替米貝干預(yù)組TC、FC水平下降的更為顯著(P0.001)。6.依替米貝、辛伐他汀對NAFLD幼魚肝臟組織病理的影響光鏡下對照組幼魚肝細胞結(jié)構(gòu)正常,無脂質(zhì)空泡；2.5%高脂高膽固醇組幼魚肝組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)異常,可見彌漫性的脂質(zhì)空泡；造模同時給予依替米貝和辛伐他汀干預(yù)后,與2.5%高脂高膽固醇組相比,幼魚肝細胞脂肪變性情況有一定程度的減輕。第三章非酒精性脂肪肝發(fā)病機制和藥物作用機制的探討第一部分非酒精性脂肪肝發(fā)病機制的探討1.高脂飼料和高脂聯(lián)合高膽固醇飼料喂食對脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達水平的影響喂食10天后,fasn,hmgcra mRNA表達量在高脂組較對照組的表達水平顯著下降,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)：與對照組相比,pparab,cpt1α和icox3 mRNA表達量顯著增高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)；其他基因表達和對照組無差異。與對照組相比,acaca, fasn, srebf2, hmgcsl和hmgcra mRNA在兩個不同濃度高脂高膽固醇組表達量均顯著下降(P0.05), pparab,cpt1α和acox3 mRNA表達量顯著增高(P0.05)。2.高脂飼料和高脂聯(lián)合高膽固醇飼料喂食對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因表達水平的影響喂食10天后,與對照組相比,atf6,ern2, hspa5和hsp90bl mRNA在高脂組的表達量顯著增高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),而eif2ak3和ddit3在兩組間表達無差異(P0.05)。與對照組相比,兩個濃度的高脂高膽固醇組atf6, hspa5和hsp90blmRNA表達量均顯著增高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。喂食20天后,與對照組相比,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因atf6, hspa5, hsp90bl和ddit3 mRNA在高脂組和高脂高膽固醇組的表達量顯著增高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.高脂飼料和高脂聯(lián)合高膽固醇飼料喂食對炎癥因子表達水平的影響喂食10天后,il6 mRNA在5.0%高脂高膽固醇組的表達量較對照組升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.005),其他基因在各組中表達均無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。喂食20天后,與對照組相比,炎癥因子tnfa, il1b和il6 mRNA在高脂組表達量顯著增高,具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；與高脂組相比,高脂高膽固醇組的上調(diào)的更為顯著。第二部分依替米貝、辛伐他汀對NALFD斑馬魚保護作用的機制探討1.依替米貝、辛伐他汀對膽固醇合成關(guān)鍵基因srebf2, hmgcsl和hmgcra mRNA表達量的影響與對照組相比,2.5%高脂高膽固醇組srebf2, hmgcsl和hmgcra mRNA表達水平顯著降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)；與對照組相比,依替米貝干預(yù)組srebf2, hmgcsl和hmgcra mRNA表達量無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；與對照組相比,辛伐他汀干預(yù)組表達水平顯著降低,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01)�？梢�,依替米貝干預(yù)后可以有效逆轉(zhuǎn)高脂高膽固醇喂食引起的srebf2, hmgcsl和hmgcra的表達下調(diào),而辛伐他汀干預(yù)后效果不明顯。2.依替米貝、辛伐他汀對脂質(zhì)分解關(guān)鍵基因pparab,cpt1α,acox3 mRNA表達量的影響與對照組相比,2.5%高脂高膽固醇組pparab, cpt1α和acox3 mRNA表達水平顯著升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.01); pparab, cpt1α和acox3 mRNA表達量在2.5%高脂高膽固醇組和依替米貝干預(yù)組間無顯著差異(P 0.05)。acox3 mRNA表達量在2.5%高脂高膽固醇組和辛伐他汀干預(yù)組間有顯著差異(P=0.018),而pparab和cpt1α mRNA表達量在2.5%高脂高膽固醇組和辛伐他汀干預(yù)組間無顯著差異(P0.05)。3.依替米貝、辛伐他汀對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵基因atf6,hspa5,hsp90bl mRNA表達量的影響與對照組相比,2.5%高脂高膽固醇組atf6, hspa5和hsp90bl mRNA表達水平顯著升高,具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.001)；與2.5%高脂高膽固醇組相比,atf6, hspa5和hsp90bl mRNA表達量在依替米貝干預(yù)組顯著降低(P0.05)。與2.5%高脂高膽固醇組相比,atf6, hspa5和hsp90bl mRNA表達量在辛伐他汀干預(yù)組也顯著降低(P0.05)。4.依替米貝、辛伐他汀對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵蛋白GRP78/BiP表達量的影響與對照組相比,2.5%高脂高膽固醇組能夠顯著誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)關(guān)鍵蛋白GRP78/BiP的表達增加；與2.5%高脂高膽固醇組相比,依替米貝和辛伐他汀干預(yù)后,GRP78/BiP蛋白的表達量有所下降。結(jié)論1.本研究通過高脂飼料和高脂聯(lián)合高膽固醇飼料的喂食的方法在國內(nèi)外首次成功地建立了非酒精性脂肪肝斑馬魚幼魚模型。2.兩種降脂藥物依替米貝和辛伐他汀可以有效改善高脂高膽固醇飼料喂食誘導(dǎo)的幼魚脂肪肝,其作用機制可能是通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝相關(guān)通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激關(guān)鍵基因和蛋白的表達從而有效地改善幼魚脂肪肝。3.斑馬魚幼魚是活體研究非酒精性脂肪肝和進行相關(guān)藥物篩選的有效的臨床前模式生物,本研究為進一步開展在體降脂新藥的篩選提供了新的實驗思路。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.5;R-332

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1 李潔斐,李衛(wèi)華,金泰^，

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