本文關(guān)鍵詞：大鼠肝再生中Fcgr2a啟動(dòng)子區(qū)甲基化變化和作用研究

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【摘要】：肝臟是人和動(dòng)物體內(nèi)負(fù)責(zé)代謝的樞紐器官,具有強(qiáng)大的再生能力[1],其具體調(diào)控機(jī)制是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。在正常條件下,絕大多數(shù)肝細(xì)胞處于靜息狀態(tài),然而當(dāng)肝臟受到創(chuàng)傷、切除、壞死等肝損傷刺激后,會(huì)引發(fā)一系列病理生理過(guò)程,這種現(xiàn)象被稱為肝再生(liver regeneration,LR)。該過(guò)程是由肝臟各種細(xì)胞和各種肝外器官協(xié)同配合完成的,涉及到復(fù)雜的分子機(jī)制。肝再生過(guò)程為活體肝移植(living donor liver transplantation,LDLT)和術(shù)后修復(fù)提供了重要的研究思路。DNA甲基化是一種廣泛存在于真核生物和原核生物中的表觀遺傳現(xiàn)象,本篇我們主要研究真核生物體內(nèi)的DNA甲基化現(xiàn)象。在真核生物體內(nèi),S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體,將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶上,這個(gè)胞嘧啶一般位于CpG雙核苷酸上,這一過(guò)程是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化完成的。在啟動(dòng)子區(qū)域和基因調(diào)節(jié)區(qū)域,CpG島的甲基化程度降低,其基因的表達(dá)通常會(huì)升高,反之,GpG島的甲基化程度升高,其基因的表達(dá)多表現(xiàn)為降低。另外這兩個(gè)區(qū)域的甲基化程度對(duì)于細(xì)胞分化也起著重要的作用[2,3]。應(yīng)用第二代測(cè)序技術(shù)(Next Generation Sequencing,NGS)對(duì)清晰闡述基因組中甲基化的分布模式,深入了解生物發(fā)育及其發(fā)病機(jī)制具有及其重要的意義,這是僅僅靠小范圍測(cè)量CpG位點(diǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能達(dá)到的。因此我們使用了甲基化基因的免疫共沉淀測(cè)序(Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing,MeDIP-seq)技術(shù)檢測(cè)肝再生早期0h、2h、6h甲基化信號(hào)源的分布,發(fā)現(xiàn)其廣泛分布于每一條染色體上。且有76%-80%的讀長(zhǎng)序列(reads)可以比對(duì)上參考基因組。進(jìn)一步分析基因組水平的甲基化基因的種類和數(shù)量,發(fā)現(xiàn)在大鼠肝再生的2h和6h,5207個(gè)基因的甲基化水平高于或低于對(duì)照2倍,稱為有意義甲基化變化基因,與相應(yīng)對(duì)照組比較后,得到了114個(gè)肝再生相關(guān)的甲基化基因(FDR≤0.05)。其中,在2h差異的有90個(gè)基因,6h差異的有71個(gè)基因。使用GO和IPA軟件分析上述114個(gè)肝再生相關(guān)的甲基化基因,發(fā)現(xiàn)有18個(gè)甲基化基因參與了40條肝再生相關(guān)的信號(hào)通路,52個(gè)甲基化基因參與37種生理活動(dòng)。為了檢驗(yàn)上述篩選方法是否正確,分析是否有效,我們采取了亞硫酸氫鹽測(cè)序(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)方法對(duì)肝再生相關(guān)甲基化基因Fcgr2a的啟動(dòng)子區(qū)域做進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果表明,擴(kuò)增片段共包括24個(gè)CpG位點(diǎn),其中有15個(gè)(CpG 5-CpG 19)位于CpG島上。重點(diǎn)分析CpG島發(fā)現(xiàn),PH 2h的甲基化程度顯著高于對(duì)照,其中CpG位點(diǎn)9、12、13、16、17差異極顯著。與此同時(shí),我們利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)其mRNA在肝再生中的表達(dá)動(dòng)態(tài),利用Western Blot技術(shù)檢測(cè)其蛋白表達(dá)動(dòng)態(tài)。結(jié)果表明,mRNA在PH 2h-12h和PH36h的表達(dá)量顯著低于對(duì)照。其蛋白表達(dá)量也于PH 2h開始逐漸下降,并在PH 6h達(dá)到最低,這與mRNA的表達(dá)趨勢(shì)一致。這種變化可能與該基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島在PH 2h的甲基化程度顯著升高有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：河南師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575

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1 韓淑媛;黃志強(qiáng);劉永雄;于國(guó);咎世明;張曙光;李暉;;大鼠肝部分切除后肝再生過(guò)程的動(dòng)態(tài)觀察[J];傳染病信息;1995年02期

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7 李瀚e，

本文編號(hào)：1156447