本文關(guān)鍵詞：人肝再生增強因子在pichia pastoris中表達、純化及活性檢測

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【摘要】：目的：建立一套便于純化的肝再生增強因子真核表達系統(tǒng),為后續(xù)更好地研究肝再生增強因子的生物學功能奠定基礎(chǔ)。方法：1.用基因重組技術(shù)和聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)方法,從重組質(zhì)粒pPIC9K-rhALR中擴增出編碼rhALR的基因片段。純化后的ALR基因和pPICZαA空質(zhì)粒,分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶Xho I和Xba I雙酶切。酶切產(chǎn)物純化后進行DNA連接酶連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZaA-rhALR。2.經(jīng)PCR、雙酶切和測序鑒定的重組質(zhì)粒pPICZaA-rhALR,由限制性內(nèi)切酶SacI單酶切線性化后電轉(zhuǎn)入酵母菌GS115中,在含博來霉素(Zeocin)的YPD平板上篩選陽性轉(zhuǎn)化子,隨后再在含Zeocin濃度遞增的YPD板上篩選高拷貝子。酵母菌落PCR鑒定后的高拷貝菌,在1%甲醇誘導(dǎo)下,分泌表達rhALR。表達上清蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳和Western Blot(ALR多克隆抗體和His-tag標簽抗體)鑒定。3.表達上清經(jīng)鎳柱親和層析純化,再用截留分子量為7kD的透析袋予以透析處理。SDS-PAGE凝膠電泳分析純化效果,BCA試劑測得目的蛋白濃度。4.MTS試劑檢測rhALR體外對人肝癌細胞(HepG2、QGY)的促增殖活性,及其對順鉑處理的QGY細胞增殖抑制率影響。流式細胞儀檢測rhALR在順鉑(DDP)誘導(dǎo)肝癌細胞株QGY凋亡時的抗凋亡作用。結(jié)果：1.成功構(gòu)建rhALR 15kD亞型酵母表達重組質(zhì)粒pPICZaA-rhALR。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、雙酶切及測序鑒定均與預(yù)期結(jié)果一致。2.成功構(gòu)建pPICZaA-rhALR GS115真核表達系統(tǒng)。在含Zeocin 2000μg/ml YPD板中篩出多顆高拷貝菌,菌落PCR鑒定重組菌為Mut-型,即甲醇利用正常型。rhALR被分泌表達于上清,占上清總表達蛋白的70%以上,Western Blot均可見單一的分子量約為17.5 kD的條帶。3.SDS-PAGE凝膠電泳分析純化后產(chǎn)物,可見單一的,濃縮的目的蛋白條帶。BCA試劑測得超濾濃縮后目的蛋白濃度約為(800-1600)μg/ml。4.MTS試劑測得rhALR對HepG2細胞和QGY細胞的體外促增殖作用呈濃度依賴性增強,也可濃度依賴式緩解順鉑處理的QGY細胞增殖抑制率。而流式細胞儀檢測法測得其對順鉑誘導(dǎo)的人肝癌細胞亦有呈濃度梯度式的抗凋亡作用。結(jié)論：成功構(gòu)建能高效分泌表達rhALR的pPICZaA-rhALR GS115酵母表達系統(tǒng),表達產(chǎn)物易于鎳柱親和純化。體外實驗證實該系統(tǒng)表達的rhALR具有良好的生物活性。
【學位授予單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575

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