本文關(guān)鍵詞：脂質(zhì)自噬在BPA所致肝臟脂質(zhì)沉積中的作用研究

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【摘要】：目的：環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A (Bisphenol A, BPA)可促進(jìn)肝臟脂質(zhì)沉積,但其機(jī)制尚不清楚。而脂質(zhì)自噬減弱可導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積的發(fā)生,其是否介導(dǎo)BPA所致的肝臟脂質(zhì)沉積,目前尚不清楚,本研究通過(guò)體內(nèi)外模型揭示脂質(zhì)自噬在BPA所致肝臟脂質(zhì)沉積中的作用。方法：在體外實(shí)驗(yàn)中,將HepG2細(xì)胞分為對(duì)照組、BPA不同濃度(1、0.001、1、4、10μM)干預(yù)組、陽(yáng)性對(duì)照組即200μM油酸(Oleic acid,OA)聯(lián)合400μM軟脂酸(Palmitic acid, PA)。分別給予上述不同干預(yù)24h。采用化學(xué)酶促-比色法定量檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(Triglyceride, TG)含量,油紅O及Bodipy 493/503熒光染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴,以明確體外脂質(zhì)沉積模型構(gòu)建是否成功。Real-time PCR及Western blot、免疫熒光等方法檢測(cè)在不同干預(yù)情況下HepG2細(xì)胞內(nèi)與自噬相關(guān)的指標(biāo)LC3、P62的表達(dá)水平,透射電鏡觀察自噬體數(shù)量,并對(duì)自噬的各個(gè)階段進(jìn)行分析：①自噬的啟動(dòng)階段：Western blot等方法檢測(cè)p-mTOR、p-ULK1、Atg5表達(dá)水平；②自噬體與溶酶體融合階段：免疫熒光檢測(cè)LC3與LAMP1共定位；③溶酶體降解階段：AO染色檢測(cè)溶酶體酸度、Calthepsin L表達(dá)水平。進(jìn)一步用10μMBPA干預(yù)原代肝細(xì)胞,對(duì)上述部分關(guān)鍵結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,分別用不同濃度BPA (5、50、500μg/kg/day)喂養(yǎng)CD1小鼠42天后,檢測(cè)肝臟脂質(zhì)沉積,從體內(nèi)驗(yàn)證脂質(zhì)沉積模型是否成功建立,并進(jìn)一步對(duì)自噬相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè),從體內(nèi)對(duì)體外相關(guān)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：體外HepG2肝細(xì)胞及原代肝細(xì)胞中：1、不同濃度干預(yù)后,細(xì)胞內(nèi)TG含量不同程度增加,其中10μM BPA組升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。油紅O染色及Bodipy 493/503脂滴染色結(jié)果與TG結(jié)果一致。2、Western blot及免疫熒光結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,10μMBPA干預(yù)后LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯增加,.同時(shí)與自噬降解關(guān)系密切的蛋白P62表達(dá)亦增加,加用抑制劑CQ阻斷自噬體降解后,BPA組LC3-Ⅱ的表達(dá)較單用CQ組降低,自噬通量受損。透射電鏡觀察到10μM BPA組自噬體數(shù)量堆積。3、對(duì)自噬過(guò)程的各個(gè)階段進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)：a、啟動(dòng)階段：10μMBPA干預(yù)后p-ULK1、p-mTOR表達(dá)增加,Atg5表達(dá)減少(p0.05)；b、融合階段：10μMBPA干預(yù)后LC3與LAMP1融合減少；c、溶酶體降解階段：與對(duì)照組相比,10μM BPA干預(yù)組AO染色熒光小點(diǎn)明顯減少,溶酶體酸度明顯減弱；Cathepesin L蛋白表達(dá)減少(p0.05)。體內(nèi)試驗(yàn)中,與對(duì)照組相比,50、500μg/kg/day BPA干預(yù)組CDl小鼠肝臟中TG含量明顯增加(p0.05),油紅O染色結(jié)果與TG結(jié)果一致；與對(duì)照組相比,BPA 500組LC3-Ⅱ表達(dá)、P62表達(dá)明顯增加,Cathepesin L蛋白表達(dá)減少(p0.05)。結(jié)論：在體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)BPA可導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積,同時(shí)自噬啟動(dòng)、自噬體與溶酶體融合、溶酶體功能及對(duì)自噬體降解作用減弱。自噬通路受損,自噬體堆積。這些結(jié)果表明,在BPA所致的肝臟脂質(zhì)沉積中,脂質(zhì)自噬可能參與了BPA所致的肝臟脂質(zhì)沉積。
【關(guān)鍵詞】：脂質(zhì)自噬 雙酚A 脂質(zhì)沉積 自噬
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575
【目錄】：

• 英漢縮略語(yǔ)名詞對(duì)照5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-14
• 1 材料與方法14-34
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-49
• 3 討論49-53
• 全文總結(jié)53-54
• 參考文獻(xiàn)54-57
• 文獻(xiàn)綜述57-68
• 參考文獻(xiàn)64-68
• 致謝68-69
• 碩士期間發(fā)表的論文69

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本文編號(hào)：1127099