本文關鍵詞：藥物性肝損傷體外篩選模型和何首烏致肝損傷的初步研究

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【摘要】：藥物性肝損傷(Drug-induced liver injury, DILI)常常是藥物研發(fā)失敗、上市后被撤市或限制使用的主要原因之一。因此,無論是上市前還是上市后,對有肝損傷風險的藥物,建立有效、靈敏、特異的體外DILI篩選模型顯得尤為重要。何首烏作為傳統補益類中藥的一種,使用十分廣泛。藥物不良反應數據顯示,它具有明顯的肝損傷風險。雖然國內外近年來進行了一些基礎性研究,但毒性成分目前仍不清楚。因此,需要對何首烏致肝損傷毒性成分及其可能的作用機制進行研究。首先,開展五種肝細胞體外模型的比較研究。選擇對乙酰氨基酚、卡馬西平、雙氯芬酸鈉、異煙肼、丙戊酸鈉、鹽酸胺碘酮、鹽酸四環(huán)素、利福平、依托泊苷、鹽酸拉貝洛爾、達那唑、雷公藤甲素、野百合堿和黃獨素B共14個藥物為DILI陽性對照,鹽酸班布特羅、鹽酸丁螺環(huán)酮和丁溴酸東莨菪堿共3個藥物為DILI陰性對照,采用CCK-8細胞毒性篩選、高內涵篩選和肝相關生化指標篩選等方法,對L-02、 HepG2、 HepaRG和hiHeps等四種人源肝細胞系和一種原代大鼠肝細胞(Primary rat liver cells, PRLs)進行比較研究。結果表明,HepaRG肝細胞系鑒別DIIL藥物的能力最高,并依鑒別DILI藥物的能力將其排序為HepaRG L-02 HepG2= hiHeps PRLs. HepaRG肝細胞在檢測氧化應激、線粒體損傷以及內質網應激等方面靈敏性較高,呈劑量依賴性,優(yōu)于其他四種肝細胞。在相關性分析和顯著性檢驗中,谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)、蘋果酸脫氫酶(Malate dehydrogenase, MDH)可同時反映雙氯芬酸鈉、鹽酸丁螺環(huán)酮和達那唑對HepaRG肝細胞的影響,提示可以作為探索DILI藥物的肝損傷相關生物標志物。其次,對何首烏致肝損傷成分進行研究。一方面,我們對何首烏藥材進行提取和分離,得到何首烏70%總醇提物和8個提取組分；另一方面,選擇易于獲得的何首烏所含的16個單體成分作為研究對象。采用CCK-8細胞毒性篩選、UPLC-PAD含量測定以及肝相關生化指標測定等方法,對何首烏70%總醇提物、8個提取組分和16個單體成分進行毒性組分和毒性成分的研究。結果表明,第四組分(Fraction 4, Fr.4)可能為何首烏致肝損傷的毒性組分,沒食子酸、白藜蘆醇、大黃素、大黃酸為何首烏中具有明顯細胞毒性的單體成分。結合L-02肝細胞損傷特征分析和含量分析,推測沒食子酸可能是何首烏致肝損傷的主要成分之一。此外,谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase, GLDH)和γ-谷氨酰轉肽酶(y-Glutamyl transferase, y-GT)都反映何首烏70%總醇提物和沒食子酸對肝細胞的損傷作用。最后,對沒食子酸致肝細胞損傷的初步機理進行研究。分別從細胞周期、細胞凋亡、高內涵篩選(活性氧、線粒體膜電位、內質網應激、中性脂代謝和鈣離子穩(wěn)態(tài))、二維凝膠電泳技術結合分子生物學驗證,探索沒食子酸在不同劑量和不同時間下對HepaRG肝細胞損傷的機理。結果表明,沒食子酸對HepaRG肝細胞的細胞周期沒有顯著影響;沒食子酸呈劑量依賴性的誘導HepaRG肝細胞凋亡；沒食子酸呈劑量依賴性和時間依賴性的誘導HepaRG肝細胞內質網應激、降低細胞內活性氧水平和鈣離子濃度,對線粒體膜電位和中性脂代謝沒有顯著影響；沒食子酸(0.5mM)在不同時間(24h和48h)處理HepaRG肝細胞,共篩選出11個差異蛋白,其中24h組有6個差異蛋白,48h組有5個差異蛋白。結合GO和Pathway分析,發(fā)現24h處理組主要集中在內質網中功能蛋白的折疊和加工方面,48 h處理組主要集中在功能蛋白折疊加工、功能蛋白前體RNA核糖核酸的調控、炎癥過程、宿主防御等方面；分子生物學驗證結果表明肽基脯氨酰順反異構酶(Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A, PPIA)的蛋白表達一致性和基因水平表達的一致性,推測PPIA可能是沒食子酸潛在的調控靶點。結論：HepaRG在鑒別DILI藥物方面優(yōu)于其他四種肝細胞(L-02、 HepG2、 hiHeps和PRLs肝細胞)；AST、LDH和MDH可以作為在體外反映DILI藥物肝損傷作用的潛在生物標志物。沒食子酸可能為何首烏致肝損傷的主要成分之一,其機制可能是通過抑制PPIA的轉錄和翻譯,引起功能蛋白的錯誤折疊和加工,造成內質網應激,進而導致肝細胞凋亡。
【關鍵詞】：藥物性肝損傷 HepaRG細胞系 生物標志物 何首烏 沒食子酸 內質網應激 肽基脯氨酰順反異構酶
【學位授予單位】：北京協和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• Abbreviations9-11
• 前言11-17
• 第一章 藥物性肝損傷體外模型的篩選17-58
• 第一節(jié) 肝細胞的制備和培養(yǎng)17-24
• 第二節(jié) CCK-8細胞毒性篩選24-32
• 第三節(jié) 高內涵篩選32-41
• 第四節(jié) 肝相關生化指標篩選41-55
• 討論55-57
• 結論57-58
• 第二章 何首烏致肝損傷毒性成分的篩選58-94
• 第一節(jié) 何首烏70%總醇提物和8個組分的制備以及16個單體成分的購置58-61
• 第二節(jié) CCK-8細胞毒性篩選61-71
• 第三節(jié) 大黃素、大黃酸、白藜蘆醇和沒食子酸的含量測定71-79
• 第四節(jié) 肝相關生化指標篩選79-89
• 討論89-93
• 結論93-94
• 第三章 何首烏致肝損傷成分的作用機制研究94-148
• 第一節(jié) 細胞周期檢測94-97
• 第二節(jié) 細胞凋亡檢測97-103
• 第三節(jié) 高內涵篩選103-108
• 第四節(jié) 二維凝膠電泳分析108-120
• 第五節(jié) Western blot驗證120-131
• 第六節(jié) q-RT-PCR驗證131-145
• 討論145-147
• 結論147-148
• 第四章 研究總結148-150
• 參考文獻150-158
• 綜述158-171
• 參考文獻166-171
• 博士在讀期間所獲成果171-172
• 致謝172-173
• 附錄173-231

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 宋海波;杜曉曦;郭曉昕;任經天;楊樂;逄瑜;;基于中醫(yī)藥古籍的何首烏安全性及風險因素分析[J];中國中藥雜志;2015年05期

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本文編號：1105062