本文關(guān)鍵詞：S1P1受體調(diào)節(jié)劑對放射引起的小腸干細(xì)胞損傷及免疫炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用研究

  更多相關(guān)文章： 小腸干細(xì)胞 譜系追蹤 炎性細(xì)胞 放射損傷

【摘要】：小腸絨毛是機(jī)體內(nèi)增殖最活躍的組織之一,小腸粘膜上皮細(xì)胞終身在不斷地自我更新,這一過程依賴小腸隱窩中的干細(xì)胞的持續(xù)增殖、分化取代外層的終末分化細(xì)胞來完成。當(dāng)照射劑量8Gy，隱窩細(xì)胞出現(xiàn)凋亡,照射劑量14Gy,隱窩細(xì)胞消失,絨毛出現(xiàn)脫落。因此胃腸的放射損傷及恢復(fù)程度與隱窩細(xì)胞或者干細(xì)胞的損傷、再生密切相關(guān)。小腸干細(xì)胞分子表面標(biāo)志的研究進(jìn)展緩慢,一直制約著對小腸干細(xì)胞調(diào)控及胃腸損傷機(jī)制的研究。直到近幾年來,利用基因小鼠模型和譜系追蹤技術(shù),才成功的鑒定到了多種小腸干細(xì)胞的分子表面標(biāo)志,確定了小腸干細(xì)胞的位置和分群。目前鑒定的小腸干細(xì)胞主要分為2類,一類為靜息干細(xì)胞,主要位于小腸隱窩基底部+4位,表面標(biāo)志包括Bmi1, mTert, Hopx及Lrig1等,另一類為Lgr5標(biāo)記的循環(huán)干細(xì)胞。其中,lgr5循環(huán)干細(xì)胞對輻射敏感,而輻射耐受的靜息干細(xì)胞可在激活后補(bǔ)充循環(huán)干細(xì)胞和快速增殖的TA細(xì)胞。前期我們的研究結(jié)果表明,S1P1受體調(diào)節(jié)劑對小腸隱窩細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。S1P1是磷脂類分子S1P的的G蛋白偶聯(lián)受體,主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞上。在維持血管通透性和完整性、淋巴細(xì)胞發(fā)育和循環(huán)上有重要的作用。因此本實驗第一部分主要應(yīng)用帶有小腸干細(xì)胞特征標(biāo)志的模式動物,如小鼠、小鼠等,研究Lgr5標(biāo)記的連續(xù)分裂ISCs和Bmi1標(biāo)記的靜態(tài)ISCs放射損傷特點,研究S1P1受體調(diào)節(jié)劑對放射后小腸干細(xì)胞組織重建的調(diào)控作用。首先我們培育并鑒定、鼠,然后通過他莫西芬誘導(dǎo)并在誘導(dǎo)后5d觀察到熒光細(xì)胞從隱窩開始向絨毛頂尖處移動,由此建立了小腸干細(xì)胞分析檢測方法。其次通過不同照射劑量的摸索觀察放射對小腸干細(xì)胞的影響,發(fā)現(xiàn)在10Gy腹部照射和12Gy全身照射下,可觀察到小腸干細(xì)胞在照射后從消失到再生的過程。隨后研究了S1P1受體調(diào)節(jié)劑對不同照射劑量下小腸干細(xì)胞組織重建的調(diào)控作用,發(fā)現(xiàn)S1P1受體調(diào)節(jié)劑CYM5442對16Gy高劑量局部照射小鼠沒有明顯的治療作用；在15Gy全身照射后3.5d CYM5442并不能有效的增加Lgr5+細(xì)胞的數(shù)量,但能有效的促進(jìn)隱窩細(xì)胞的增殖。我們通過分離不同腸道組織(十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸),發(fā)現(xiàn)10Gy和12Gy全身照射下S1P1受體激動劑CYM5442能在照射后3.5d和7d提高各個腸段組織再生隱窩的數(shù)量。應(yīng)用qPCR的方法檢測了15Gy照射后干細(xì)胞相關(guān)基因(Lgr5、olfm4、mTert、Hopx、Lrig1、Bmi1、Ascl2)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)S1P1受體調(diào)節(jié)劑CYM5442在照后6h顯著提高這些基因的表達(dá)、照后1d對mTert、Bmil等+4位基因依然有著提高的作用,照后3.5d對干細(xì)胞相關(guān)基因則影響不大。小腸粘膜在輻射誘導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)中是高敏感的器官。小腸在受到放射損傷后會產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子。因此在第二部分實驗中我們應(yīng)用流式細(xì)胞分析等技術(shù)重點觀察天然免疫細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核—巨噬細(xì)胞等在照后不同時間的變化,分析炎癥免疫細(xì)胞浸潤與放射損傷發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系,并研究S1P1受體調(diào)節(jié)劑對炎性反應(yīng)的調(diào)控作用。我們通過分離小鼠小腸固有層細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)在15Gy全身照射后24h和48h,SlP1受體調(diào)節(jié)劑CYM5442能顯著減少中性粒細(xì)胞的數(shù)量,但對其它類型的細(xì)胞群體沒有影響。隨后用qPCR的方法檢測了15Gy照射后炎性因子相關(guān)基因(白介素類IL-1b、IL-6、IL-10、IL-12b,趨化因子Ccl2、Ccl5, Cxcl1、Cxcl2、Cxcl10,粘附分子Icaml、Vcaml)的表達(dá),發(fā)現(xiàn)S1P1受體調(diào)節(jié)劑CYM5442在照射后6h抑制白介素類和趨化因子,提高粘附分子的表達(dá)。照射后1d反而提高白介素類和趨化因子,抑制粘附分子。照射后3.5d則對這些基因影響不大。我們通過S1P1受體調(diào)節(jié)劑對小腸干細(xì)胞組織功能重建機(jī)制以及放射引起的腸道組織炎性反應(yīng)的研究,可以更好的揭示急性放射病發(fā)病新機(jī)制,同時也為基于靶點的抗放藥物設(shè)計提供了基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：小腸干細(xì)胞 譜系追蹤 炎性細(xì)胞 放射損傷
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R574.5
【目錄】：

• 個人簡歷3-7
• 縮略語表7-8
• 摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-20
• 第一章 S1P1受體調(diào)節(jié)劑對放射后小腸干細(xì)胞組織重建的調(diào)控作用20-55
• 1 實驗材料21-23
• 1.1 實驗動物21-22
• 1.2 實驗試劑22
• 1.3 儀器與耗材22-23
• 2 實驗方法23-35
• 2.1 Lgr5~(tml(cre/ERT2))；Gt(ROSA)26Sor~(tml(Smo/EYFP))和Bmi1~(tml(cre/ERT));Gt(ROSA)26Sor~(tml(Smo/EYFP))小鼠基因型的鑒定23-24
• 2.2 利用Lgr5~(tml(cre/ERT2))；Gt(ROSA)26Sor~(tml(Smo/EYFP))小鼠建立小鼠小腸干細(xì)胞分析檢測方法24-26
• 2.3 應(yīng)用Lgr5、Bmi1干細(xì)胞分子標(biāo)志小鼠觀察放射對小腸干細(xì)胞損傷的影響26-28
• 2.4 S1P1受體調(diào)節(jié)劑對不同劑量照射的小鼠小腸干細(xì)胞的損傷及組織重建的影響28-31
• 2.5 S1P1受體調(diào)節(jié)劑對15Gy照射后小鼠小腸干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)的影響31-35
• 3 實驗結(jié)果35-53
• 3.1 Lgr5~(tml(cre/ERT2))；Gt(ROSA)26Sor~(tml(Smo/EYFP))和Bmil~(tml(cre/ERT))；Gt(ROSA)26Sor~(tml(Smo/EYFP))小鼠基因型的鑒定35-36
• 3.2 利用Lgr5~(tml(cre/ERT2))；Gt(ROSA)26Sor~(tml(Smo/EYFP))小鼠建立小鼠小腸干細(xì)胞分析檢測方法36-40
• 3.3 應(yīng)用Lgr5、Bmi1干細(xì)胞分子標(biāo)志小鼠觀察放射對小腸干細(xì)胞損傷的影響40-45
• 3.4 S1P1受體調(diào)節(jié)劑對不同劑量照射的小鼠小腸干細(xì)胞的損傷及組織重建的影響45-49
• 3.5 S1P1受體激動劑對15Gy全身照射后小腸干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因表達(dá)的影響49-53
• 4 討論53-55
• 第二章 S1P1受體調(diào)節(jié)劑對放射引起的炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用55-86
• 1 實驗材料56-57
• 1.1 實驗動物56
• 1.2 實驗試劑56-57
• 1.3 儀器與耗材57
• 2 實驗方法57-70
• 2.1 利用流式細(xì)胞儀建立小腸固有層細(xì)胞分析檢測方法57-63
• 2.2 15Gy全身照射對小鼠小腸固有層細(xì)胞的影響63
• 2.3 S1P1受體調(diào)節(jié)劑對15Gy全身照射小鼠照后不同時間點小腸固有層免疫炎性細(xì)胞浸潤的影響63-66
• 2.4 S1P1受體調(diào)節(jié)劑CYM5442對15Gy照射后小腸炎性細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響66-70
• 3 實驗結(jié)果70-85
• 3.1 利用流式細(xì)胞儀建立小腸固有層細(xì)胞分析檢測方法70-72
• 3.2 15Gy全身照射對小鼠小腸固有層細(xì)胞的影響72-74
• 3.3 S1P1受體調(diào)節(jié)劑對15Gy全身照射小鼠照后不同時間點小腸固有層免疫炎性細(xì)胞浸潤的影響74-81
• 3.4 S1P1受體調(diào)節(jié)劑CYM5442對15Gy照射后小腸炎性細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響81-85
• 4 討論85-86
• 參考文獻(xiàn)86-89
• 綜述 小腸干細(xì)胞表面標(biāo)志基因的研究進(jìn)展89-102
• 參考文獻(xiàn)97-102
• 致謝102-103
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄103-107

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