本文關鍵詞：姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠肝纖維化作用

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【摘要】：研究背景肝纖維化(liver fibrosis)是機體對于各種因素引起的肝臟慢性損傷修復導致細胞外基質合成增多而降解減少,過度沉積在肝臟的病理過程,是嚴重的公共衛(wèi)生問題。肝纖維化�？蛇M展為肝硬化、肝癌并最終導致死亡。揭示肝纖維化的發(fā)病機制,阻斷肝纖維化進展,對于防治肝硬化有著重要的意義。過去的研究認為肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSC)在肝纖維化的發(fā)生中起著關鍵的作用。因此,對于肝纖維化機制和干預研究長期以來都聚焦在HSC上。然而,近年來越來越多研究表明,單核／巨噬細胞參與肝臟炎癥和纖維化的發(fā)生、進展,在肝纖維化形成過程中起著更為關鍵的作用。巨噬細胞能夠通過多種途徑參與肝纖維化的發(fā)生,才是肝損傷和纖維化的中心調控者。肝損傷時肝組織巨噬細胞明顯增多,除一部分來源于固有巨噬細胞的增殖外,更重要的是肝損傷時循環(huán)中的單核細胞能夠被大量招募到損傷的肝組織,進一步分化為單核細胞來源的巨噬細胞,參與肝纖維化的發(fā)生和進展。單核細胞趨化蛋白1 (monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)在肝組織內單核細胞浸潤中起著關鍵的作用。MCP-1能通過作用外周血中的循環(huán)單核細胞表面的單核細胞趨化蛋白受體2(C-C chemokine receptor type 2, CCR-2),將外周血單核細胞招募到肝臟的炎癥部位,演變?yōu)閱魏思毎麃碓吹木奘杉毎麉⑴c肝臟損傷和纖維化。現(xiàn)有的研究已表明肝組織單核細胞來源的巨噬細胞在肝纖維化的發(fā)生中起著關鍵的作用,而MCP-1是單核細胞浸潤重要的細胞因子,但這些研究主要來源于動物實驗研究,在各種慢性肝病(chronic liver diseases, CLD)導致的肝纖維化患者中,肝組織巨噬細胞和外周血單核細胞浸潤及MCP-1表達情況尚需要進一步研究證實。對于肝纖維化的治療,盡管國內外進行了大量的研究,并取得一定的成果,但是幾乎沒有真正進入臨床用于治療肝纖維化的有效藥物。鑒于MCP-1介導的單核細胞浸潤在肝損傷和纖維化中的中心調控作用,通過抑制MCP-1進而減輕肝組織內單核細胞浸潤已成為抗肝損傷和肝纖維化的新靶點。姜黃素(Curcumin)是一種從姜黃屬姜黃、郁金、莪術等中藥的根莖中提取的天然多酚類化合物。許多動物實驗表明姜黃素具有較好的抗肝損傷和肝纖維化作用,但其作用機制尚不完全清楚。我們推測姜黃素能夠通過抑制MCP-1減輕單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤發(fā)揮抗肝損傷和纖維化的作用。本研究首先收集不同病因導致的CLD患者肝組織標本,采用免疫組織化學的方法對不同病因導致的CLD患者肝組織中單核細胞來源的巨噬細胞及MCP-1水平進行分析,以明確單核細胞來源的巨噬細胞及MCP-1表達與CLD患者肝纖維化的關系。進一步通過建立CCl4誘導的小鼠肝損傷和肝纖維化模型,驗證單核細胞來源的巨噬細胞及MCP-1在肝損傷和纖維化中的作用,并觀察姜黃素抗肝損傷和纖維化的作用,探討姜黃素抑制MCP-1減輕單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗肝損傷和纖維化的作用機理,為姜黃素的應用提供理論依據(jù),同時為肝纖維化的治療提供新的思路。方法第一部分 慢性肝病患者肝組織內單核細胞來源的巨噬細胞浸潤研究收集93例CLD患者,包括慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者65例,原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)患者7例,自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)患者14例,酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)患者7例及23例正常供肝組織石蠟標本,采用免疫組織化學方法檢測CLD患者及正常對照肝組織中CD68+巨噬細胞和MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞浸潤情況及MCP-1表達。比較不同病因的CLD患者與正常對照組肝組織CD68+巨噬細胞和MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞及MCP-1表達情況的差異及其與炎癥分級和纖維化分期的關系。第二部分 姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠急性肝損傷和肝纖維化作用1.姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠急性肝損傷作用：C57BL/6小鼠單次腹腔注射CCl4建立急性肝損傷模型并給予姜黃素灌胃干預,檢測各組小鼠血清谷丙轉氨酶(alanine amiotransferase, ALT)和谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase, AST)水平；進行小鼠肝組織HE染色,評價姜黃素的抗急性肝損傷作用；流式細胞術檢測小鼠肝組織內T細胞、樹突狀細胞(dendritic cells, DC)、自然殺傷(natural killer, NK)細胞及NKT細胞、單核細胞來源的巨噬細胞及其亞群比例。并采用抗CD45抗體、抗F4/80抗體、抗CD11b抗體進行免疫組織化學分析,檢測各組小鼠肝組織內CD45+白細胞、F4/80+巨噬細胞、CD11b+單核細胞浸潤情況。Real time PCR檢測小鼠肝組織內炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達。Real time PCR及免疫組織化學法檢測小鼠肝組織MCP-1的表達。2.姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠肝纖維化作用：C57BL/6小鼠反復腹腔注射CC14,連續(xù)6周,建立肝纖維化模型,姜黃素灌胃給藥,檢測各組小鼠血清ALT和AST水平；小鼠肝組織HE染色、Masson染色,評價姜黃素的抗肝纖維化作用。流式細胞術檢測小鼠肝組織中T細胞、DC細胞、NK細胞及NKT細胞、單核細胞來源的巨噬細胞及其亞群比例。并采用免疫組織化學方法檢測各組小鼠肝組織內CD45+白細胞、F4/80+巨噬細胞、CD11b+單核細胞浸潤情況。Real time PCR檢測小鼠肝組織內TNF-α、IL-6、 IL-1β、TGF-β1 mRNA表達。Real time PCR及免疫組織化學法檢測小鼠肝組織MCP-1的表達。免疫組織化學檢測小鼠肝組織內α-SMA表達,探討姜黃素對HSC活化的影響。結果第一部分慢性肝病患者肝組織內單核細胞來源的巨噬細胞浸潤研究1. CHB、PBC、AIH及ALD患者肝組織內CD68+巨噬細胞均較正常對照肝組織明顯增多。而不同病因所導致的CLD患者之間,CD68+巨噬細胞數(shù)量無明顯的統(tǒng)計學差異。隨著炎癥(G)分級的增高,CLD患者肝組織內CD68+巨噬細胞比例明顯增高。不同纖維化分期的CLD患者,肝組織內CD68+巨噬細胞的數(shù)量均較正常對照組明顯增多,但不同纖維化(S)分期的CLD患者之間無明顯統(tǒng)計學差異。CLD患者肝組織內CD68+巨噬細胞數(shù)量與CLD患者ALT、AST、GGT、 Tbil水平及Child-Pugh評分均呈明顯的正相關,與Alb等水平無明顯的相關性。2.CHB、PBC、AIH及ALD患者肝組織內MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞均較正常對照肝組織明顯增多,而不同病因CLD患者肝組織內MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞無明顯統(tǒng)計學差異。不同G分級的CLD患者肝組織內MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞數(shù)量均較正常對照組增高,G4級CLD患者肝組織內MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞數(shù)量明顯高于G1、G2及G3級的患者。不同纖維化分期的CLD患者,肝組織內MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞數(shù)量均較正常對照組明顯增多,而S4期患者MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞數(shù)量又明顯高于S0-1、S2及S3期CLD患者。CLD患者肝組織內MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞數(shù)量與CLD患者ALT、AST、GGT、Tbil水平及Child-Pugh評分均無明顯的相關性,而與Alb呈負相關,與CRP水平呈正相關。3.正常對照肝組織,僅有很少量MCP-1表達,而CLD患者肝組織內可見大量MCP-1表達。CLD患者肝組織內MCP-1評分較正常對照組明顯增高。CHB、PBC、AIH及ALD肝組織內MCP-1評分均較正常對照組肝組織明顯增高,而CHB和ALD患者肝組織內MCP-1評分略高于PBC和AIH患者。與MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞一致,不同G分級的CLD患者肝組織內MCP-1表達均較正常對照組增高,G4級CLD患者肝組織內MCP-1表達亦高于G2和G3級的患者。不同纖維化分期的CLD患者,肝組織內MCP-1評分均較正常對照組明顯增高,而S4期患者MCP-1評分又明顯高于S0-1、S2及S3期CLD患者。相關性分析發(fā)現(xiàn)MCP-1表達與CD68+巨噬細胞及MAC387+單核細胞來源的巨噬細胞數(shù)量均呈明顯的正相關。第二部分姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠急性肝損傷和肝纖維化作用1.姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠急性肝損傷作用：CC14單次注射可以顯著造成小鼠急性肝損傷,表現(xiàn)為CC14注射48 h后小鼠血清ALT、AST水平較正常組明顯增高；肝組織HE染色示,CC14注射后小鼠肝組織肝細胞大量壞死,并伴有炎癥細胞浸潤。姜黃素治療并不能顯著減低小鼠血清ALT、AST水平,但可以明顯減輕小鼠肝細胞損傷和炎癥細胞浸潤。CC14單次腹腔注射后,小鼠肝組織單核細胞來源的巨噬細胞比例較正常對照組明顯增加,而增加的單核細胞來源的巨噬細胞主要為Grlhi單核細胞來源的巨噬細胞。而其他細胞如T細胞、DC細胞、NK細胞及NKT細胞變化不明顯。姜黃素能夠明顯抑制單核細胞來源的巨噬細胞的浸潤,能抑制Grlhi單核細胞來源的巨噬細胞。免疫組化分析示模型組肝組織內CD45+白細胞、F4/80+巨噬細胞、CD11b+單核細胞較正常對照組明顯增加,而姜黃素組可以明顯減少這些細胞的浸潤。CCl4注射48 h后小鼠肝組織炎癥因子TNF-α、IL-6較正常對照組明顯增高,IL-1β亦有增高的趨勢。姜黃素組小鼠肝組織內TNF-α、IL-6、IL-1β較模型組并無明顯降低。Real time PCR檢測各組小鼠肝組織MCP-1的mRNA表達水平,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝組織內MCP-1表達水平較正常對照組明顯升高。而姜黃素組小鼠肝組織內MCP-1 mRNA水平亦明顯高于正常對照組,但較模型組無明顯降低。進一步對小鼠肝組織采用MCP-1抗體進行免疫組化分析,結果發(fā)現(xiàn)模型組肝組織內MCP-1表達明顯較正常對照組增強,而姜黃素組小鼠肝組織MCP-1染色明顯弱于模型組。2.姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠肝纖維化作用：CC14反復注射可以顯著造成小鼠肝纖維化,表現(xiàn)為小鼠血清ALT、AST水平較正常組明顯增高；肝組織HE染色示,肝細胞大量壞死,小葉結構紊亂,并伴有炎癥細胞浸潤；Masson染色示小鼠肝組織內膠原纖維較正常對照組明顯增多,肝小葉纖維間隔形成。姜黃素治療能顯著減低小鼠血清ALT、AST水平,明顯減輕小鼠肝細胞損傷和炎癥細胞浸潤,減輕肝組織纖維增生。CC14反復腹腔注射后,模型組小鼠肝組織單核細胞來源的巨噬細胞比例較正常對照組明顯增加,而增加的單核細胞來源的巨噬細胞主要為Gr1hi單核細胞來源的巨噬細胞。模型組CD3+T細胞比例及DC細胞比例明顯高于正常對照組,而NK及NKT細胞比例明顯低于正常對照組。而姜黃素對T細胞、DC細胞、NK細胞及NKT細胞無明顯影響。但姜黃素能夠明顯抑制單核細胞來源的巨噬細胞的浸潤,主要以抑制Grlhi單核細胞來源的巨噬細胞亞群為主。免疫組化分析示模型組小鼠肝組織內CD45+白細胞、F4/80+巨噬細胞、CD11b+單核細胞較正常對照組明顯增加,而姜黃素可以明顯減少這些細胞的浸潤。CCl4注射6周后模型組小鼠TNF-α水平較正常對照組明顯增高,IL-1β、IL-6 mRNA水平亦呈增高趨勢,而姜黃素能明顯降低肝組織內促炎因子TNF-a mRNA表達。模型組小鼠肝組織內TGF-β1、 mRNA水平較正常對照組明顯增高,而姜黃素干預后小鼠肝組織內TGF-β1 mRNA水平較模型組明顯降低。Real time PCR及免疫組織化學檢測各組小鼠肝組織MCP-1的表達水平,結果提示模型組小鼠肝組織內MCP-1表達水平較正常對照組明顯升高。而姜黃素能明顯降低小鼠肝組織內MCP-1表達水平。小鼠肝組織MCP-1免疫組化也有同樣發(fā)現(xiàn)。此外,α-SMA免疫組化還表明,姜黃素能明顯抑制α-SMA表達,提示其能抑制HSC的活化。結論1.不同病因的CLD患者肝組織內巨噬細胞及單核細胞來源的巨噬細胞明顯增多且與肝臟的炎癥程度和纖維化程度相關；MCP-1可能介導了CLD患者肝組織內的單核細胞浸潤；2.姜黃素具有抗急性肝損傷和肝纖維化的作用,其抗急性肝損傷和肝纖維化的作用機制可能與其抑制肝組織內MCP-1表達進一步抑制Grlhi單核細胞來源巨噬細胞肝臟浸潤有關。
【關鍵詞】：肝纖維化 單核細胞來源的巨噬細胞 姜黃素 單核細胞趨化蛋白1
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-20
• 縮略詞表20-23
• 前言23-34
• 參考文獻28-34
• 第一部分 慢性肝病患者肝組織內單核細胞來源的巨噬細胞浸潤研究34-60
• 引言34-36
• 材料和方法36-42
• 實驗結果42-52
• 討論52-55
• 結論55-56
• 參考文獻56-60
• 第二部分 姜黃素抑制單核細胞來源的巨噬細胞肝臟浸潤抗小鼠急性肝損傷和肝纖維化作用60-101
• 引言60-61
• 材料與方法61-74
• 實驗結果74-92
• 討論92-96
• 結論96-97
• 參考文獻97-101
• 綜述101-116
• 參考文獻109-116
• 攻讀博士學位期間取得的研究成果116-124
• 致謝124-125
• 作者簡介125

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Correlation between anti-fibrotic effect of baicalin and serum cytokines in rat hepatic fibrosis[J];World Journal of Gastroenterology;2009年37期

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本文編號：1097948