發(fā)布時(shí)間：2017-10-26 09:03

  本文關(guān)鍵詞：姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠肝纖維化作用

  更多相關(guān)文章： 肝纖維化 單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞 姜黃素 單核細(xì)胞趨化蛋白1

【摘要】：研究背景肝纖維化(liver fibrosis)是機(jī)體對(duì)于各種因素引起的肝臟慢性損傷修復(fù)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增多而降解減少,過(guò)度沉積在肝臟的病理過(guò)程,是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。肝纖維化�？蛇M(jìn)展為肝硬化、肝癌并最終導(dǎo)致死亡。揭示肝纖維化的發(fā)病機(jī)制,阻斷肝纖維化進(jìn)展,對(duì)于防治肝硬化有著重要的意義。過(guò)去的研究認(rèn)為肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSC)在肝纖維化的發(fā)生中起著關(guān)鍵的作用。因此,對(duì)于肝纖維化機(jī)制和干預(yù)研究長(zhǎng)期以來(lái)都聚焦在HSC上。然而,近年來(lái)越來(lái)越多研究表明,單核／巨噬細(xì)胞參與肝臟炎癥和纖維化的發(fā)生、進(jìn)展,在肝纖維化形成過(guò)程中起著更為關(guān)鍵的作用。巨噬細(xì)胞能夠通過(guò)多種途徑參與肝纖維化的發(fā)生,才是肝損傷和纖維化的中心調(diào)控者。肝損傷時(shí)肝組織巨噬細(xì)胞明顯增多,除一部分來(lái)源于固有巨噬細(xì)胞的增殖外,更重要的是肝損傷時(shí)循環(huán)中的單核細(xì)胞能夠被大量招募到損傷的肝組織,進(jìn)一步分化為單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞,參與肝纖維化的發(fā)生和進(jìn)展。單核細(xì)胞趨化蛋白1 (monocyte chemotactic protein 1, MCP-1)在肝組織內(nèi)單核細(xì)胞浸潤(rùn)中起著關(guān)鍵的作用。MCP-1能通過(guò)作用外周血中的循環(huán)單核細(xì)胞表面的單核細(xì)胞趨化蛋白受體2(C-C chemokine receptor type 2, CCR-2),將外周血單核細(xì)胞招募到肝臟的炎癥部位,演變?yōu)閱魏思?xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞參與肝臟損傷和纖維化。現(xiàn)有的研究已表明肝組織單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞在肝纖維化的發(fā)生中起著關(guān)鍵的作用,而MCP-1是單核細(xì)胞浸潤(rùn)重要的細(xì)胞因子,但這些研究主要來(lái)源于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究,在各種慢性肝病(chronic liver diseases, CLD)導(dǎo)致的肝纖維化患者中,肝組織巨噬細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞浸潤(rùn)及MCP-1表達(dá)情況尚需要進(jìn)一步研究證實(shí)。對(duì)于肝纖維化的治療,盡管?chē)?guó)內(nèi)外進(jìn)行了大量的研究,并取得一定的成果,但是幾乎沒(méi)有真正進(jìn)入臨床用于治療肝纖維化的有效藥物。鑒于MCP-1介導(dǎo)的單核細(xì)胞浸潤(rùn)在肝損傷和纖維化中的中心調(diào)控作用,通過(guò)抑制MCP-1進(jìn)而減輕肝組織內(nèi)單核細(xì)胞浸潤(rùn)已成為抗肝損傷和肝纖維化的新靶點(diǎn)。姜黃素(Curcumin)是一種從姜黃屬姜黃、郁金、莪術(shù)等中藥的根莖中提取的天然多酚類化合物。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明姜黃素具有較好的抗肝損傷和肝纖維化作用,但其作用機(jī)制尚不完全清楚。我們推測(cè)姜黃素能夠通過(guò)抑制MCP-1減輕單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)發(fā)揮抗肝損傷和纖維化的作用。本研究首先收集不同病因?qū)е碌腃LD患者肝組織標(biāo)本,采用免疫組織化學(xué)的方法對(duì)不同病因?qū)е碌腃LD患者肝組織中單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞及MCP-1水平進(jìn)行分析,以明確單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞及MCP-1表達(dá)與CLD患者肝纖維化的關(guān)系。進(jìn)一步通過(guò)建立CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷和肝纖維化模型,驗(yàn)證單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞及MCP-1在肝損傷和纖維化中的作用,并觀察姜黃素抗肝損傷和纖維化的作用,探討姜黃素抑制MCP-1減輕單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗肝損傷和纖維化的作用機(jī)理,為姜黃素的應(yīng)用提供理論依據(jù),同時(shí)為肝纖維化的治療提供新的思路。方法第一部分 慢性肝病患者肝組織內(nèi)單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)研究收集93例CLD患者,包括慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者65例,原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC)患者7例,自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)患者14例,酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)患者7例及23例正常供肝組織石蠟標(biāo)本,采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)CLD患者及正常對(duì)照肝組織中CD68+巨噬細(xì)胞和MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)情況及MCP-1表達(dá)。比較不同病因的CLD患者與正常對(duì)照組肝組織CD68+巨噬細(xì)胞和MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞及MCP-1表達(dá)情況的差異及其與炎癥分級(jí)和纖維化分期的關(guān)系。第二部分 姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠急性肝損傷和肝纖維化作用1.姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠急性肝損傷作用：C57BL/6小鼠單次腹腔注射CCl4建立急性肝損傷模型并給予姜黃素灌胃干預(yù),檢測(cè)各組小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine amiotransferase, ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase, AST)水平；進(jìn)行小鼠肝組織HE染色,評(píng)價(jià)姜黃素的抗急性肝損傷作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝組織內(nèi)T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cells, DC)、自然殺傷(natural killer, NK)細(xì)胞及NKT細(xì)胞、單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞及其亞群比例。并采用抗CD45抗體、抗F4/80抗體、抗CD11b抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)分析,檢測(cè)各組小鼠肝組織內(nèi)CD45+白細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞、CD11b+單核細(xì)胞浸潤(rùn)情況。Real time PCR檢測(cè)小鼠肝組織內(nèi)炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β mRNA表達(dá)。Real time PCR及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠肝組織MCP-1的表達(dá)。2.姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠肝纖維化作用：C57BL/6小鼠反復(fù)腹腔注射CC14,連續(xù)6周,建立肝纖維化模型,姜黃素灌胃給藥,檢測(cè)各組小鼠血清ALT和AST水平；小鼠肝組織HE染色、Masson染色,評(píng)價(jià)姜黃素的抗肝纖維化作用。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肝組織中T細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞、單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞及其亞群比例。并采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)各組小鼠肝組織內(nèi)CD45+白細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞、CD11b+單核細(xì)胞浸潤(rùn)情況。Real time PCR檢測(cè)小鼠肝組織內(nèi)TNF-α、IL-6、 IL-1β、TGF-β1 mRNA表達(dá)。Real time PCR及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)小鼠肝組織MCP-1的表達(dá)。免疫組織化學(xué)檢測(cè)小鼠肝組織內(nèi)α-SMA表達(dá),探討姜黃素對(duì)HSC活化的影響。結(jié)果第一部分慢性肝病患者肝組織內(nèi)單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)研究1. CHB、PBC、AIH及ALD患者肝組織內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞均較正常對(duì)照肝組織明顯增多。而不同病因所導(dǎo)致的CLD患者之間,CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著炎癥(G)分級(jí)的增高,CLD患者肝組織內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞比例明顯增高。不同纖維化分期的CLD患者,肝組織內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞的數(shù)量均較正常對(duì)照組明顯增多,但不同纖維化(S)分期的CLD患者之間無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。CLD患者肝組織內(nèi)CD68+巨噬細(xì)胞數(shù)量與CLD患者ALT、AST、GGT、 Tbil水平及Child-Pugh評(píng)分均呈明顯的正相關(guān),與Alb等水平無(wú)明顯的相關(guān)性。2.CHB、PBC、AIH及ALD患者肝組織內(nèi)MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞均較正常對(duì)照肝組織明顯增多,而不同病因CLD患者肝組織內(nèi)MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。不同G分級(jí)的CLD患者肝組織內(nèi)MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞數(shù)量均較正常對(duì)照組增高,G4級(jí)CLD患者肝組織內(nèi)MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯高于G1、G2及G3級(jí)的患者。不同纖維化分期的CLD患者,肝組織內(nèi)MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞數(shù)量均較正常對(duì)照組明顯增多,而S4期患者M(jìn)AC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞數(shù)量又明顯高于S0-1、S2及S3期CLD患者。CLD患者肝組織內(nèi)MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞數(shù)量與CLD患者ALT、AST、GGT、Tbil水平及Child-Pugh評(píng)分均無(wú)明顯的相關(guān)性,而與Alb呈負(fù)相關(guān),與CRP水平呈正相關(guān)。3.正常對(duì)照肝組織,僅有很少量MCP-1表達(dá),而CLD患者肝組織內(nèi)可見(jiàn)大量MCP-1表達(dá)。CLD患者肝組織內(nèi)MCP-1評(píng)分較正常對(duì)照組明顯增高。CHB、PBC、AIH及ALD肝組織內(nèi)MCP-1評(píng)分均較正常對(duì)照組肝組織明顯增高,而CHB和ALD患者肝組織內(nèi)MCP-1評(píng)分略高于PBC和AIH患者。與MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞一致,不同G分級(jí)的CLD患者肝組織內(nèi)MCP-1表達(dá)均較正常對(duì)照組增高,G4級(jí)CLD患者肝組織內(nèi)MCP-1表達(dá)亦高于G2和G3級(jí)的患者。不同纖維化分期的CLD患者,肝組織內(nèi)MCP-1評(píng)分均較正常對(duì)照組明顯增高,而S4期患者M(jìn)CP-1評(píng)分又明顯高于S0-1、S2及S3期CLD患者。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MCP-1表達(dá)與CD68+巨噬細(xì)胞及MAC387+單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞數(shù)量均呈明顯的正相關(guān)。第二部分姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠急性肝損傷和肝纖維化作用1.姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠急性肝損傷作用：CC14單次注射可以顯著造成小鼠急性肝損傷,表現(xiàn)為CC14注射48 h后小鼠血清ALT、AST水平較正常組明顯增高；肝組織HE染色示,CC14注射后小鼠肝組織肝細(xì)胞大量壞死,并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。姜黃素治療并不能顯著減低小鼠血清ALT、AST水平,但可以明顯減輕小鼠肝細(xì)胞損傷和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。CC14單次腹腔注射后,小鼠肝組織單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞比例較正常對(duì)照組明顯增加,而增加的單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞主要為Grlhi單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞。而其他細(xì)胞如T細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞變化不明顯。姜黃素能夠明顯抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn),能抑制Grlhi單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞。免疫組化分析示模型組肝組織內(nèi)CD45+白細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞、CD11b+單核細(xì)胞較正常對(duì)照組明顯增加,而姜黃素組可以明顯減少這些細(xì)胞的浸潤(rùn)。CCl4注射48 h后小鼠肝組織炎癥因子TNF-α、IL-6較正常對(duì)照組明顯增高,IL-1β亦有增高的趨勢(shì)。姜黃素組小鼠肝組織內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β較模型組并無(wú)明顯降低。Real time PCR檢測(cè)各組小鼠肝組織MCP-1的mRNA表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肝組織內(nèi)MCP-1表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高。而姜黃素組小鼠肝組織內(nèi)MCP-1 mRNA水平亦明顯高于正常對(duì)照組,但較模型組無(wú)明顯降低。進(jìn)一步對(duì)小鼠肝組織采用MCP-1抗體進(jìn)行免疫組化分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組肝組織內(nèi)MCP-1表達(dá)明顯較正常對(duì)照組增強(qiáng),而姜黃素組小鼠肝組織MCP-1染色明顯弱于模型組。2.姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠肝纖維化作用：CC14反復(fù)注射可以顯著造成小鼠肝纖維化,表現(xiàn)為小鼠血清ALT、AST水平較正常組明顯增高；肝組織HE染色示,肝細(xì)胞大量壞死,小葉結(jié)構(gòu)紊亂,并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Masson染色示小鼠肝組織內(nèi)膠原纖維較正常對(duì)照組明顯增多,肝小葉纖維間隔形成。姜黃素治療能顯著減低小鼠血清ALT、AST水平,明顯減輕小鼠肝細(xì)胞損傷和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),減輕肝組織纖維增生。CC14反復(fù)腹腔注射后,模型組小鼠肝組織單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞比例較正常對(duì)照組明顯增加,而增加的單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞主要為Gr1hi單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞。模型組CD3+T細(xì)胞比例及DC細(xì)胞比例明顯高于正常對(duì)照組,而NK及NKT細(xì)胞比例明顯低于正常對(duì)照組。而姜黃素對(duì)T細(xì)胞、DC細(xì)胞、NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞無(wú)明顯影響。但姜黃素能夠明顯抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn),主要以抑制Grlhi單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞亞群為主。免疫組化分析示模型組小鼠肝組織內(nèi)CD45+白細(xì)胞、F4/80+巨噬細(xì)胞、CD11b+單核細(xì)胞較正常對(duì)照組明顯增加,而姜黃素可以明顯減少這些細(xì)胞的浸潤(rùn)。CCl4注射6周后模型組小鼠TNF-α水平較正常對(duì)照組明顯增高,IL-1β、IL-6 mRNA水平亦呈增高趨勢(shì),而姜黃素能明顯降低肝組織內(nèi)促炎因子TNF-a mRNA表達(dá)。模型組小鼠肝組織內(nèi)TGF-β1、 mRNA水平較正常對(duì)照組明顯增高,而姜黃素干預(yù)后小鼠肝組織內(nèi)TGF-β1 mRNA水平較模型組明顯降低。Real time PCR及免疫組織化學(xué)檢測(cè)各組小鼠肝組織MCP-1的表達(dá)水平,結(jié)果提示模型組小鼠肝組織內(nèi)MCP-1表達(dá)水平較正常對(duì)照組明顯升高。而姜黃素能明顯降低小鼠肝組織內(nèi)MCP-1表達(dá)水平。小鼠肝組織MCP-1免疫組化也有同樣發(fā)現(xiàn)。此外,α-SMA免疫組化還表明,姜黃素能明顯抑制α-SMA表達(dá),提示其能抑制HSC的活化。結(jié)論1.不同病因的CLD患者肝組織內(nèi)巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞明顯增多且與肝臟的炎癥程度和纖維化程度相關(guān)；MCP-1可能介導(dǎo)了CLD患者肝組織內(nèi)的單核細(xì)胞浸潤(rùn)；2.姜黃素具有抗急性肝損傷和肝纖維化的作用,其抗急性肝損傷和肝纖維化的作用機(jī)制可能與其抑制肝組織內(nèi)MCP-1表達(dá)進(jìn)一步抑制Grlhi單核細(xì)胞來(lái)源巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：肝纖維化 單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞 姜黃素 單核細(xì)胞趨化蛋白1
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-20
• 縮略詞表20-23
• 前言23-34
• 參考文獻(xiàn)28-34
• 第一部分 慢性肝病患者肝組織內(nèi)單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)研究34-60
• 引言34-36
• 材料和方法36-42
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-52
• 討論52-55
• 結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-60
• 第二部分 姜黃素抑制單核細(xì)胞來(lái)源的巨噬細(xì)胞肝臟浸潤(rùn)抗小鼠急性肝損傷和肝纖維化作用60-101
• 引言60-61
• 材料與方法61-74
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果74-92
• 討論92-96
• 結(jié)論96-97
• 參考文獻(xiàn)97-101
• 綜述101-116
• 參考文獻(xiàn)109-116
• 攻讀博士學(xué)位期間取得的研究成果116-124
• 致謝124-125
• 作者簡(jiǎn)介125

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Correlation between anti-fibrotic effect of baicalin and serum cytokines in rat hepatic fibrosis[J];World Journal of Gastroenterology;2009年37期

，

本文編號(hào)：1097948