本文關(guān)鍵詞：Akt2與HBV DNA水平相關(guān)性及其機(jī)制研究

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【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)的主要目的是研究慢性乙肝病毒性肝炎患者Akt2基因與乙肝病毒載量的關(guān)系;探究HBV DNA對(duì)Akt2表達(dá)的影響;構(gòu)建并評(píng)價(jià)慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾在人Hep G2.2.15中的基因沉默效應(yīng)及沉默后乙肝患者中HBV DNA表達(dá)情況。方法:收集240例乙肝患者及80名健康人的外周血,利用熒光定量PCR檢測(cè)乙肝患者血中HBV的病毒載量,將實(shí)驗(yàn)對(duì)象分為三組,根據(jù)HBV DNA病毒載量的高低:將患者分組,HBV DNA1×107拷貝/ml定為高病毒載量組、1×105拷貝/ml≤HBV DNA≤1×107拷貝/ml定為中病毒載量組,HBV DNA1×105拷貝/ml定于低病毒載量組。ELISA法檢測(cè)4組外周血的Akt2的含量;比較四組中Akt2的表達(dá)差異;培養(yǎng)Hep G2及Hep G2.2.15細(xì)胞,并提取兩類(lèi)細(xì)胞中的RNA,并逆轉(zhuǎn)錄成c DNA,采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(RT-PCR)檢測(cè)兩類(lèi)細(xì)胞中Akt2 m RNA的表達(dá)水平;設(shè)計(jì)Akt2的RNAi寡聚核苷酸序列;慢病毒載體構(gòu)建Akt2的sh RNA載體,轉(zhuǎn)染入大腸桿菌并觀察重組表達(dá)狀況;得到重組腺病毒需要利用293T細(xì)胞包裝;綠色熒光蛋白(GFP)作為標(biāo)記,逐孔稀釋法確定轉(zhuǎn)染效率及滴度;以實(shí)時(shí)熒光定量法比較各組對(duì)Akt2m RNA的干擾效果。最后采用ELISA法檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Hep G2.2.15細(xì)胞上清液中Akt2的表達(dá)水平。結(jié)果:80例健康人血清Akt2的含量為292±15ng/ml;低病毒載量組的80例患者其血清Akt2的含量為378±21ng/ml;中病毒載量組的80例患者血清Akt2的含量為537±18ng/ml,而高病毒載量組的80例患者血清中Akt2含量為622±12ng/ml。CHB患者的不同病毒載量組間及與健康對(duì)照組對(duì)比,其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P1,2,30.001);Hep G2.2.15細(xì)胞中Akt2 m RNA的表達(dá)水平較Hep G2高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);篩選了所構(gòu)建的3個(gè)Akt2靶向序列,包裝sh RNA慢病毒后轉(zhuǎn)染Hep G2.2.15細(xì)胞并檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后的沉默效率(效率達(dá)到85%),比較得出沉默效率最高的靶序列和工作條件。在細(xì)胞培養(yǎng)上清液中,實(shí)驗(yàn)組的Hep G2.2.15細(xì)胞上清液HBV DNA病毒載量為3.63×106拷貝/ml,而對(duì)照組中上清液HBV DNA病毒載量為5.17×106拷貝/ml。兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.05。結(jié)論:慢性乙型肝炎患者血清Akt2的含量與HBV DNA載量密切相關(guān);HBV能夠在m RNA和蛋白水平上調(diào)肝癌細(xì)胞Akt2的表達(dá);Akt2的表達(dá)量降低細(xì)胞中HBV DNA的分泌量減少。在臨床水平和細(xì)胞`水平證實(shí)Akt2與乙型肝炎病毒復(fù)制密切相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：慢病毒 Akt2 病毒載量 HBV 基因沉默
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62
【目錄】：

• 摘要2-3
• Abstract3-7
• 引言7-9
• 第一部分 慢性乙肝患者血清中Akt2的表達(dá)與HBV DNA的關(guān)系研究9-15
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料9-10
• 1.1.1 主要儀器和設(shè)備9
• 1.1.2 主要試劑和器材9-10
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法10-13
• 1.2.1 研究對(duì)象10
• 1.2.2 血清中HBV DNA載量的測(cè)定10
• 1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組10
• 1.2.4 血清Akt2表達(dá)水平的測(cè)定10-12
• 1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析12-13
• 1.3 結(jié)果13-14
• 1.3.1 慢性乙型病毒肝炎患者HBV DNA病毒載量和細(xì)胞中Akt2蛋白表達(dá)水平的比較13-14
• 1.4 討論14-15
• 第二部分 Akt2基因在人HepG2和HepG2.2.15中的表達(dá)特點(diǎn)15-24
• 2.1 HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞的培養(yǎng)和觀察15-20
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料15-16
• 2.1.1.0 細(xì)胞株15
• 2.1.1.1 主要儀器設(shè)備15
• 2.1.1.2 主要試劑和器材15-16
• 2.1.1.3 主要試劑的配制及保存16
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)方法16-19
• 2.1.2.1 HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞的復(fù)蘇16-17
• 2.1.2.2 HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞的換液17
• 2.1.2.3 HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞的傳代17-18
• 2.1.2.4 HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞的凍存18-19
• 2.1.3 結(jié)果19-20
• 2.2 HBV對(duì)HepG2和HepG2.2.15中Akt2表達(dá)的影響20-24
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)方法20-23
• 2.2.1.1 人肝癌細(xì)胞系HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中Akt2mRNA的提取20-21
• 2.2.1.2 HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞總RNA的測(cè)定21-22
• 2.2.1.3 逆轉(zhuǎn)錄制備cDNA22
• 2.2.1.4 Real-time PCR檢測(cè)HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞中Akt2的表達(dá)22-23
• 2.2.2 Akt2m RNA 表達(dá)量的計(jì)算方法23-24
• 第三部分 慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾人HepG2.2.15細(xì)胞Akt2基因表達(dá)及兩組細(xì)胞中細(xì)胞上清液中HBV的含量24-37
• 3.1 慢病毒介導(dǎo)的shRNA干擾人HepG2.2.15細(xì)胞Akt2基因表達(dá)24-28
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)方法24-28
• 3.1.1.1 慢病毒載體構(gòu)建24-26
• 3.1.1.2 慢病毒包裝及滴度鑒定26
• 3.1.1.3 shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞26
• 3.1.1.4 驗(yàn)證目的基因的表達(dá)26-28
• 3.2 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV的含量28
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)方法28
• 3.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析28-29
• 3.4 結(jié)果29-35
• 3.4.1 HepG2和HepG2.2.15中Akt2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量29
• 3.4.2 載體質(zhì)粒構(gòu)建成功29-32
• 3.4.3 在 HepG2.2.15細(xì)胞中評(píng)價(jià)重組慢病毒載體的干擾活性32-35
• 3.5 討論35-37
• 第四部分 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 綜述41-50
• 綜述參考文獻(xiàn)46-50
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果50-51
• 縮略詞51-52
• 致謝52-53

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