本文關(guān)鍵詞：間質(zhì)細(xì)胞mTOR信號通路活化加重CC14所致肝纖維化

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【摘要】：一、研究背景肝纖維化是全球發(fā)病率較高的疾病,它不是一個獨立的疾病,許多慢性肝臟疾病均可引起肝纖維化,包括慢性病毒性肝炎,酒精性肝炎和非酒精性脂肪肝炎等。肝纖維化是指由各種致病因子所致肝損傷修復(fù)的過程伴隨結(jié)締組織異常增生,以肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積為特點的病理過程。越來越多的研究著眼于肝纖維化的病理機制,肌成纖維細(xì)胞(MF)以其合成并分泌膠原促進(jìn)肝臟ECM的累積和收縮能力成為研究的熱點。MF雖來源廣泛,肝星狀細(xì)胞(HSCs)依然是CC14所致的小鼠肝纖維化模型中肌成纖維細(xì)胞的主要來源。肝損傷時HSCs由靜止的富含維生素的星狀細(xì)胞活化為具有增殖、收縮和促纖維化能力的肌成纖維細(xì)胞,這樣的細(xì)胞轉(zhuǎn)變在理解肝纖維化發(fā)病機制的道路上具有劃時代意義。HSCs不僅在肝損傷具有重要的功能,在肝發(fā)育、再生、異型生物質(zhì)反應(yīng)、代謝、免疫調(diào)節(jié)方面都發(fā)揮著重要的作用。與此同時,無數(shù)的研究利用組織免疫組織化學(xué)鑒定肝星狀細(xì)胞,但迄今為止最具代表性的蛋白質(zhì)包括平滑肌肌動蛋白(α -SMA)、結(jié)蛋白(desmin)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin)是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。其在體內(nèi)由兩種不同的復(fù)合物組成,分別是mTORC1 (mTOR complex 1)和mTORC2 (mTOR complex 2)。mTORC1包括mTOR、Raptor、mLST8、PRAS40和Deptor; mTORC2包括mTOR、Rictor、 mSIN1、Protor-1、LST8和Deptor。結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物(TSC1/2)由TSC1和TSC2組成,對mTOR功能起負(fù)性調(diào)控作用,TSC1的缺失會導(dǎo)致組織細(xì)胞中mTOC1活性的持續(xù)激活。mTOC1可對細(xì)胞內(nèi)外多種刺激產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng),通過磷酸化其下游蛋白4EBP1和P70S6K,進(jìn)而增加mRNA翻譯效率,增加蛋白質(zhì)合成,調(diào)控細(xì)胞生長和增殖。在一定條件下,通過雷帕霉素抑制mTORC1活性可以促進(jìn)凋亡。mTOR的突變激活會引起凋亡抵抗,可能導(dǎo)致細(xì)胞轉(zhuǎn)化。據(jù)報道,mTOR信號通路活化與多種纖維化疾病有關(guān)。mTOR信號通路在心肌纖維化中起重要作用,雷帕霉素作為mTOR信號通路抑制劑可以緩解心臟纖維化。雷帕霉素類似物SDZ和RAD對博萊霉素致小鼠肺纖維化模型中膠原積累有明顯的抑制作用,抑制mTOR對肺纖維化有潛在的治療作用。mTORC1信號信號通路可以促進(jìn)腎成纖維細(xì)胞的活化,并有助于腎間質(zhì)纖維化的發(fā)展。越來越多的證據(jù)支持mTOR信號通路在肝纖維化起重要作用。肝星狀細(xì)胞激活是肝纖維化的發(fā)病機制中的關(guān)鍵步驟。肝星狀細(xì)胞是位于Disse間隙內(nèi),緊貼著肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞的間質(zhì)細(xì)胞。我們推測的mTOR信號通路在間充質(zhì)細(xì)胞激活對肝纖維化有重要作用。二、研究方法1、基于Cre-loxp系統(tǒng),我們成功構(gòu)建了間質(zhì)細(xì)胞特異性TSC1敲除小鼠。應(yīng)用PCR和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行小鼠基因型的鑒定。2、他莫昔芬誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞特異性TSC1敲除小鼠,用western blot和免疫熒光確定TSC1敲除效果。3、采用四氯化碳(CC14)小鼠腹腔注射給藥,模擬肝纖維化模型,對照組給予同等劑量甘油。檢測小鼠血清的ALT,肝組織檢測勻漿羥脯氨酸(HYP)。取肝組織進(jìn)行HE和天狼星紅染色,觀察小鼠肝組織的損傷程度和膠原增生的情況。4、在小鼠動物模型,通過免疫組化及western blot方法,評估在間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)mTOR過度活化情況下對肝纖維化形成的影響。5、通過對間質(zhì)細(xì)胞特異性敲除TSC1mRNA分析,初步探討mTORC1信號通路對促纖維化發(fā)生發(fā)展的基因的影響6、在小鼠動物模型,使用western blot檢測及免疫熒光來評估小鼠肝組織內(nèi)的增殖及凋亡水平變化情況。三、統(tǒng)計學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均代表3次或以上重復(fù)實驗的結(jié)果,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,每組數(shù)據(jù)使用t檢驗進(jìn)行分析。檢驗水準(zhǔn)：P0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。四、研究結(jié)果1、構(gòu)建間質(zhì)細(xì)胞特異性TSC1敲除小鼠,并對2月齡小鼠進(jìn)行他莫昔芬誘導(dǎo),使其產(chǎn)生敲除效果。純合子TSC1小鼠(Tsc1fl/fl)與含有Cre-ER (T)重組酶基因的小鼠雜交繁殖出Cre/TSC1雜合的老鼠。經(jīng)過第二代雜交繁殖出Cre酶陽性純合子[TSC1fl/fl, ColⅠα2-CreER(T)+/0]和Cre酶陰性純合子[TSC1fl/fl, ColIa2-CreER(T)0/0]小鼠。我們裂解鼠尾組織樣本提取DNA,應(yīng)用PCR和瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因型鑒定。接著對2月齡的小鼠分別持續(xù)給予他莫昔芬8天,產(chǎn)生間質(zhì)細(xì)胞特異敲除TSC1小鼠(TSC1 CKO)及對照野生型小鼠(WT)。給藥1個月后取肝組織,通過western blot和免疫熒光驗證敲除效果。肝組織勻漿裂解,通過western blot檢測肝組織蛋白mTORC 1下游靶蛋白S6的磷酸化水平。我們發(fā)現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞TSC1特異性敲除小鼠p-S6 (5235/S236)的水平顯著升高。肝組織固定包埋,免疫熒光發(fā)現(xiàn)p-S6(5235/S236)表達(dá)陽性的細(xì)胞顯著增多。2、間質(zhì)細(xì)胞敲除TSC1加重CC14致小鼠肝纖維化。評估間質(zhì)細(xì)胞敲除TSC1對CC14致小鼠肝纖維化的影響,取TSC1 CKO和WT老鼠肝組織固定包埋,進(jìn)行HE染色和天狼星紅染色染色觀察肝損傷程度及膠原形成情況。與WT老鼠相比,TSC1 CKO的老鼠表現(xiàn)出明顯的肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和橋接壞死。TSC1 CKO小鼠呈現(xiàn)出膠原沉積增加,天狼星紅染色陽性面積增多,肝羥脯氨酸作為肝內(nèi)膠原降解產(chǎn)物在敲除鼠內(nèi)也明顯升高。同樣的,TSC1 CKO小鼠血清ALT也明顯升高相對于WT老鼠。總的來說,這些結(jié)果表明,在間質(zhì)細(xì)胞敲除TSC1加重CC14所致的小鼠肝纖維化。3、間質(zhì)細(xì)胞TSC1缺失增加a-SMA表達(dá)。鑒于我們上面的分析已確定間質(zhì)細(xì)胞TSC1缺失導(dǎo)致四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化加重。與上面形態(tài)學(xué)結(jié)果一致,在CC1 4誘導(dǎo)模型中TSC1 CKO小鼠肝組織a-SMA蛋白表達(dá)增加。免疫組化分析證實在TSC1 CKO小鼠中a-SMA蛋白表達(dá)陽性的細(xì)胞顯著增多。橄欖油處理后,WT和TSC1 CKO小鼠肝組織a-SMA的表達(dá)沒有明顯的差異。這些結(jié)果表明,從間質(zhì)細(xì)胞TSC1缺失促進(jìn)肝纖維化的發(fā)展。4、TSC1 CKO小鼠肝纖維化標(biāo)志物的表達(dá)增加。RT-PCR以定量纖維化標(biāo)記物的表達(dá)。四氯化碳誘的纖維化模型中,TSC1 CKO小鼠a-SMA,Ⅰ型膠原,TGF-β和TIMP2明顯增加相對于WT小鼠而言。這些標(biāo)記物在橄欖油誘導(dǎo)小鼠中沒有明顯差異。這一結(jié)果更進(jìn)一步說明了TSC1 CKO小鼠對四氯化碳誘導(dǎo)肝纖維化明顯的易感性。5、肝纖維化模型中TSC1 CKO小鼠肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts， MF)增多。為了進(jìn)一步明確mTOR活性對MF增加的原因,通過蛋白質(zhì)檢測和免疫熒光分析。正如所料,四氯化碳處理的小鼠,S6磷酸化水平上調(diào),但在TSC1 CKO升高的更明顯。我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)凋亡蛋白的蛋白水平,PARP和活化的caspas3在CCl 4處理的小鼠肝組織表達(dá)降低,但在TSC1 CKO降低的更加明顯。通過免疫熒光分析用α-SMA抗體測定肌成纖維細(xì)胞的形成。與western blot的結(jié)果一致,在CC14處理的小鼠肝組織,TSC1 CKO小鼠S6磷酸化水平增加對肌成纖維細(xì)胞形成有一定的促進(jìn)作用。Ki67和α-SMA雙陽性細(xì)胞被認(rèn)為是增殖的肌成纖維細(xì)胞,CCl 4處理的小鼠肝組織中顯著增多,但TSC1 CKO小鼠增加更為顯著�；罨腸aspas3和α-SMA的雙陽性細(xì)胞,在TSC1 CKO肝纖維化模型鼠肝臟組織中明顯降低,這是公認(rèn)的凋亡肌成纖維細(xì)胞。有趣的是,在橄欖油處理過的小鼠肝臟中α-SMA,Ki67和活化的caspas3表達(dá)不會有明顯改變。這表明在型膠原TSC1的靜態(tài)條件失去我表達(dá)細(xì)胞并沒有伴隨著肌纖維母細(xì)胞在肝臟的外觀增加。因此,在間質(zhì)細(xì)胞特異性敲除TSC1導(dǎo)致間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)rnTOR信號通路過度活化,mTOR活化能促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生從而加重四氯化碳所致小鼠肝纖維化。五、結(jié)論1、肝纖維化發(fā)病程中伴隨著mTOR信號通路的活化。2、間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)敲除TSC1,mTOR信號通路活化促進(jìn)肝纖維化發(fā)病。3、間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)mTOR信號通路活化促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞增殖加重肝纖維化。4、間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)mTOR信號通路活化通過減少肌成纖維細(xì)胞凋亡加重肝纖維化。
【關(guān)鍵詞】：肝纖維化 肌成纖維細(xì)胞 條件性基因敲除 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 增殖 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-17
• 第一章 前言17-23
• 1.1 肝纖維化與肝星狀細(xì)胞17
• 1.2 mTOR信號通路簡介17-19
• 1.3 mTOR信號通路與纖維化疾病的關(guān)系19
• 1.4 Cre-loxp系統(tǒng)簡介19-23
• 第二章 材料與方法23-45
• 2.1 實驗動物23
• 2.2 試劑與耗材23
• 2.3 主要儀器23-24
• 2.4 方法24-45
• 第三章 結(jié)果45-59
• 3.1 構(gòu)建間質(zhì)細(xì)胞特異性TSC1敲除小鼠,并對2月齡小鼠進(jìn)行他莫昔芬誘導(dǎo),使其產(chǎn)生敲除效果45-47
• 3.2 間質(zhì)細(xì)胞敲除TSC1加重CCL_4致小鼠肝纖維化47-52
• 3.3 間質(zhì)細(xì)胞TSC1缺失增加α-SMA表達(dá)52-54
• 3.4 TSC1 CKO小鼠肝纖維化標(biāo)志物的表達(dá)增加54-55
• 3.5 肝纖維化模型中TSC1 CKO小鼠肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts,MF)增多55-59
• 第四章 討論59-62
• 第五章 全文小結(jié)62-63
• 第六章 參考文獻(xiàn)63-66
• 中英文縮略詞對照表66-68
• 碩士研究生期間發(fā)表論文情況68-69
• 致謝69-71

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