本文關(guān)鍵詞：miRNA-34a靶向ACSL1對肝纖維化發(fā)生發(fā)展的機制研究

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【摘要】：研究背景肝細(xì)胞肝癌是較常見的惡性腫瘤之一,在全球惡性腫瘤中,其發(fā)病率排名第五,死亡率排名第三。肝纖維化是肝組織在各類慢性肝損傷性疾病發(fā)展過程中出現(xiàn)的過度組織修復(fù),是各類慢性肝病進展為惡性結(jié)局的必經(jīng)之路。肝纖維化具有雙向病程:如果被早期診斷和治療,病情可以逆轉(zhuǎn);如果得不到有效診治,則可以進一步發(fā)展為預(yù)后極差的不可逆的肝硬化、肝癌。肝纖維化的發(fā)病機制復(fù)雜,雖然不同的病因有不同的病理生理過程,但肝星狀細(xì)胞(hepatic stellated cell,HSC)的激活引起表型改變導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)大量沉積是其發(fā)生發(fā)展病程中一個重要的共同通道。miRNA是一類在真核生物體內(nèi)存在的不具備編碼功能的小分子RNA,僅含有20~25個核苷酸。miRNA高度保守,常以家族形式存在,具有組織特異性和時序性。它們與靶基因的3’非編碼區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)以完全互補或不完全互補的形式特異性裝載進入RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體,引導(dǎo)m RNA降解或者阻止m RNA翻譯,參與細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡等。近些年研究發(fā)現(xiàn):多種miRNA能夠通過活性氧(reactive oxygen species,ROS)通道、TGF-β/smad凋亡通道、過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)和脂質(zhì)代謝等多個信號通道調(diào)控肝纖維化病程中HSC的活化和增殖能力,參與肝纖維化的病理生理過程。在前期預(yù)實驗研究中,我們使用二甲基亞硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)誘導(dǎo)了SD大鼠的肝纖維化動物模型,應(yīng)用miRNA的基因組高通量表達(dá)芯片發(fā)現(xiàn):miR-34a表達(dá)顯著增高,進一步通過實時熒光定量PCR(real time quantitative PCR,q RT-PCR)技術(shù)驗證發(fā)現(xiàn)miR-34a的表達(dá)隨著造模周期的延長而顯著增加,因此miR-34a可能在肝纖維化進程中起重要作用。本研究擬通過探索miR-34a在臨床肝纖維化病程及原代HSC自然活化增殖過程中的生物學(xué)特性,應(yīng)用分子生物學(xué)方法分析并驗證miR-34a的靶基因,進而研討miR-34a通過靶基因在肝纖維化病程中的調(diào)控機制,為肝纖維化的早期診斷和治療提供一個新的分子靶點。第一部分:miR-34a在肝纖維化進程中的表達(dá)及功能研究研究目的:檢測不同分期臨床肝纖維化組織標(biāo)本和原代HSC自然活化增殖過程中miR-34a表達(dá),分析miR-34a與肝纖維化進程和HSC活化程度的相關(guān)性。研究方法:1、收集臨床肝纖維化組織標(biāo)本,應(yīng)用HE染色、Masson染色和Van Gieson(VG)染色對臨床肝纖維化組織進行分期,q RT-PCR檢測miR-34a在臨床不同分期肝纖維化組織中的表達(dá)差異。2、Friedman二步分離法提取大鼠原代HSC并進行體外培養(yǎng),臺盼藍(lán)染色法、自發(fā)熒光實驗及免疫雙熒光實驗鑒定細(xì)胞活性、細(xì)胞純度及細(xì)胞狀態(tài),q RT-PCR檢測原代HSC體外培養(yǎng)到第2 d、第7 d和第14 d時miR-34a的表達(dá)水平。研究結(jié)果:1、依據(jù)METAVIR肝纖維化分期標(biāo)準(zhǔn),應(yīng)用HE染色、Masson染色和VG染色將臨床肝纖維化組織分為F0期、F1期、F2期、F3期、F4期。q RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn):與F0期肝組織相比,F1期、F2期、F3期、F4期肝纖維化組織中miR-34a的基因量表達(dá)分別增加6.2倍、21.3倍、32.4倍、39.8倍,P0.05。2、應(yīng)用Fridman二步法提取大鼠原代HSC,通過臺盼藍(lán)染色法、自發(fā)熒光實驗鑒定原代HSC細(xì)胞純度95%,細(xì)胞存活率95%;應(yīng)用免疫雙熒光實驗鑒定證實體外培養(yǎng)到第2 d的HSC為靜止態(tài),體外培養(yǎng)到第14 d的HSC為活化態(tài)。q RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn):與體外培養(yǎng)2 d的HSC(靜止態(tài))相比,體外培養(yǎng)到第7 d(半活化態(tài))的HSC中miR-34a表達(dá)量增加48.6倍,P0.05,體外培養(yǎng)到第14 d的HSC(活化態(tài))中miR-34a的表達(dá)量增加192.0倍,P0.05。結(jié)論:1、miR-34a的基因表達(dá)量隨著臨床肝纖維化進程逐漸增加,與肝纖維化病程正相關(guān)。2、miR-34a的基因表達(dá)量隨著原代HSC的自然活化增殖逐漸增加,與HSC的活化程度正相關(guān)。酶1(Acyl-Co A synthetase long-chain 1,Acsl1),驗證miR-34a與Acsl1的靶向關(guān)系,研究Acsl1在臨床各期肝纖維化組織和原代HSC自然活化增殖過程中的基因和蛋白表達(dá)水平。研究方法:1、以rno-miR-34a-5p為檢索詞,在micro RNA.org、Pic Tar、Target Scan、miRDB及miRbase 5個數(shù)據(jù)庫進行靶基因預(yù)測,然后在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫進行靶基因的功能顯著性(gene ontology,GO)分析,KEGG數(shù)據(jù)庫進行代謝通道的pathway分析,結(jié)合本課題組前期預(yù)實驗利用動物肝纖維化組織所獲取的miRNA-m RNA表達(dá)譜,構(gòu)建miRNA-Gene-Network,篩選出miR-34a-5p的靶基因。2、應(yīng)用p MIR-REPORT載體構(gòu)建Acsl1野生型(wild type,WT)和突變型(mutation,MUT)質(zhì)粒,雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證miR-34a與Acsl1的靶向關(guān)系。3、應(yīng)用q RT-PCR、Western Blot和免疫組化檢測ACSL1在臨床不同分期肝纖維化組織以及原代HSC自然活化增殖過程中的表達(dá)差異,分析其與miR-34a表達(dá)的相關(guān)性。研究結(jié)果:1、以rno-miR-34a-5p為檢索詞,在micro RNA.org、Pic Tar、Target Scan、miRDB及miRbase 5個數(shù)據(jù)庫進行靶基因預(yù)測,取每個數(shù)據(jù)庫前50的預(yù)測結(jié)果的交集為可能的靶基因。然后在Gene Ontology數(shù)據(jù)庫進行靶基因的GO分析,KEGG數(shù)據(jù)庫進行代謝通道的pathway分析。結(jié)合本課題組預(yù)實驗利用動物肝纖維化組織得到的miRNA-m RNA表達(dá)譜,構(gòu)建出miRNA-Gene-Network,發(fā)現(xiàn)Acsl1位于該網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控中心,受miR-34a、miR-34b、miR-34c、miR-19a、miR181a等5個miRNA的共同調(diào)控,因此Acsl1可能為rno-miR-34a的靶基因。2、通過生物信息技術(shù)分析,我們預(yù)測miR-34a-5p位點上有7個核糖核苷酸與Acsl1 3’-UTR的161-167位點互補,PCR擴增3’-UTR(Acsl1)序列構(gòu)建于載體luciferase下游的Mlu I和Hind III,構(gòu)建出Acsl1 WT質(zhì)粒(p MIR-REPORT Acsl1 WT3’UTR)。再利用點突變技術(shù)將結(jié)合位點進行突變,構(gòu)建入p MIR-REPORT luciferase載體的螢光素酶報告基因下游,構(gòu)建出Acsl1 MUT質(zhì)粒(p MIR-REPORT Acsl1 MUT3’UTR)。與共轉(zhuǎn)染Acsl1 WT質(zhì)粒和NC序列的293T工具細(xì)胞相比,共轉(zhuǎn)染Acsl1 WT質(zhì)粒和miR-34a inhibitor的工具細(xì)胞的Firefly luciferase/Renialla luciferase比值明顯上升,P0.05,說明miR-34a對Acsl1有直接負(fù)向調(diào)控作用。與共轉(zhuǎn)染Acsl1 MUT質(zhì)粒和NC序列的工具細(xì)胞相比,共轉(zhuǎn)染Acsl1 MUT質(zhì)粒和miR-34a inhibitor后,第二部分:miR-34a靶基因的篩選與驗證研究目的:應(yīng)用生物信息學(xué)技術(shù)分析和篩選出miR-34a靶基因長鏈脂酰輔酶A合成其Firefly luciferase/Renialla luciferase比值無明顯差異,P0.05,該結(jié)果說明當(dāng)Acsl13’端161-167位點發(fā)生點突變后,miR-34a不能與之特異結(jié)合,對其負(fù)向調(diào)控作用消失。Acsl1是rno-miR-34a-5p的直接作用靶點。3、q RT-PCR檢測結(jié)果顯示:F1期、F2期、F3期、F4期臨床肝纖維化組織中ACSL1的m RNA表達(dá)量分別為F0期肝組織的72.2%、44.4%、32.0%、22.2%,P0.05。相關(guān)性分析結(jié)果顯示:ACSL1在肝纖維化組織中m RNA表達(dá)量與miR-34a負(fù)相關(guān),R2=0.8221,P0.05。Western Blot檢測和免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示:從F0期到F4期,ACSL1的蛋白表達(dá)量逐步減少。4、q RT-PCR檢測結(jié)果顯示:與體外培養(yǎng)到第2 d的靜止態(tài)HSC相比,體外培養(yǎng)到第7 d、第14 d時,Acsl1的m RNA表達(dá)量分別下降22.3%、55.4%,P0.05。相關(guān)性分析結(jié)果顯示:Acsl1在HSC中的表達(dá)量與miR-34a負(fù)相關(guān),R2=0.9612,P0.05。Western Blot檢測結(jié)果顯示,體外培養(yǎng)到第2 d、第7 d、第14 d的Acsl1的蛋白表達(dá)量逐步減少。結(jié)論:1、Acsl1為miR-34a的靶基因。2、隨著臨床肝纖維化進展,ACSL1的基因和蛋白表達(dá)水平明顯降低,ACSL1的m RNA表達(dá)量與miR-34a表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。3、隨著HSC的活化,Acsl1的m RNA和蛋白表達(dá)水平逐步下降,HSC細(xì)胞中Acsl1的m RNA表達(dá)量與miR-34a表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。第三部分:miR-34a靶向Acsl1參與HSC活化增殖的相關(guān)研究研究目的:驗證miR-34a靶向Acsl1對HSC活化增殖的生物學(xué)行為作用。研究方法:1、以a HSC為研究對象,將miR-34a inhibitor轉(zhuǎn)染進入細(xì)胞中,檢測Acsl1和肝纖維化指標(biāo)I型膠原(Type I collagen,Col I)和α平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的m RNA和蛋白表達(dá)水平。2、利用a HSC構(gòu)建Acsl1干擾穩(wěn)定細(xì)胞株,檢測肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的m RNA和蛋白表達(dá)水平,判斷Acsl1對肝纖維化進程的影響。3、回復(fù)實驗(rescue assay)進一步驗證miR-34a靶向Acsl1對HSC表型的調(diào)控。研究結(jié)果:1、q RT-PCR檢測體外培養(yǎng)到第2 d(靜止態(tài))和體外培養(yǎng)到第14 d(活化態(tài))的HSC中肝纖維化指標(biāo)Col I和α-SMA的表達(dá)。結(jié)果顯示:與體外培養(yǎng)到第2 d的HSC相比,體外培養(yǎng)到第14 d的HSC中Col I的表達(dá)增加8.7倍,α-SMA的表達(dá)增加2.7倍,P0.05。Western Blot結(jié)果顯示:與體外培養(yǎng)到第2 d的HSC相比,Col I和α-SMA的蛋白表達(dá)亦出現(xiàn)顯著增加。2、將miR-34a inhibitor轉(zhuǎn)染進入a HSC,q RT-PCR和Western Blot檢測Acsl1和肝纖維化指標(biāo)(Col I和α-SMA)的m RNA和蛋白表達(dá)水平。q RT-PCR結(jié)果顯示:與NC組比較,a HSC轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor后Acsl1的m RNA表達(dá)量增加1.7倍,P0.05,Col I和α-SMA的m RNA表達(dá)量分別減少41.8%和63.5%,P0.05;而blank組與NC組相比,Acsl1、Col I和α-SMA的m RNA表達(dá)量無顯著差異,P0.05。Western Blot結(jié)果顯示:inhibitor組中Acsl1的蛋白表達(dá)量較NC組顯著增加,Col I和α-SMA的蛋白表達(dá)量顯著下降,而NC組和blank組中Acsl1、Col I和α-SMA蛋白表達(dá)差異不顯著。3、構(gòu)建帶有EGFP熒光和嘌呤霉素抗性基因標(biāo)記的大鼠Acsl1干擾慢病毒載體,通過菌落PCR鑒定陽性克隆及陽性克隆測序結(jié)果證實Acsl1干擾慢病毒載體構(gòu)建成功。將Acsl1干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)入a HSC培育Acsl1干擾穩(wěn)定細(xì)胞株Y2313、Y2314、Y2315,q RT-PCR檢測三個干擾細(xì)胞株中Acsl1的干擾效率。實驗結(jié)果顯示:與干擾對照株比較,Y2313中Acsl1的m RNA表達(dá)量減少61%,P0.05;Y2314中Acsl1的m RNA表達(dá)量減少57%,P0.05;Y2315中Acsl1的m RNA表達(dá)量減少34%,P0.05;而干擾對照細(xì)胞株和a HSC中Acsl1的m RNA表達(dá)量比較,P0.05。該結(jié)果說明,Y2313的干擾效率最高,選為下一步實驗過程中的Acsl1干擾穩(wěn)定細(xì)胞株。q RT-PCR檢測Acsl1干擾穩(wěn)定細(xì)胞株中肝纖維化相關(guān)指標(biāo)(Col I和α-SMA)的m RNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示:與干擾對照株比較,Acsl1干擾穩(wěn)定細(xì)胞株中Col I和α-SMA的m RNA表達(dá)量分別增加3.3倍和1.4倍,P0.05,而干擾對照細(xì)胞株與a HSC中Col I、α-SMA的m RNA表達(dá)量比較無顯著差異,P0.05。Western Blot結(jié)果顯示:Acsl1干擾穩(wěn)定細(xì)胞株中Col I和α-SMA的蛋白表達(dá)量較干擾對照細(xì)胞株顯著增高,而干擾對照細(xì)胞株和a HSC中Col I和α-SMA的蛋白表達(dá)差異不顯著。4、回復(fù)實驗進一步驗證miR-34a靶向Acsl1對HSC表型的調(diào)控。Acsl1干擾穩(wěn)定細(xì)胞株和干擾對照細(xì)胞株分別轉(zhuǎn)染miRNA NC和miR-34a inhibitor,觀察肝纖維化相關(guān)指標(biāo)(Col I和α-SMA)的表達(dá)。q RT-PCR結(jié)果顯示:Acsl1干擾穩(wěn)定細(xì)胞株分別轉(zhuǎn)染NC和miR-34a inhibitor后,兩組Col I和α-SMA的m RNA表達(dá)量無顯著差異,P0.05;而與轉(zhuǎn)染NC序列的干擾對照細(xì)胞株相比,轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor的干擾對照細(xì)胞株中Col I的m RNA表達(dá)量下降了25.1%,P0.05,α-SMA的m RNA表達(dá)量下降了43.9%,P0.05。Western Blot檢測各組的蛋白表達(dá)顯示:Acsl1干擾穩(wěn)定細(xì)胞株分別轉(zhuǎn)染NC和miR-34a inhibitor后,兩組Col1和α-SMA的蛋白表達(dá)無顯著差異;與轉(zhuǎn)染NC序列的干擾對照細(xì)胞株相比,轉(zhuǎn)染miR-34a inhibitor的干擾對照細(xì)胞株中Col I和α-SMA的蛋白表達(dá)均出現(xiàn)顯著下降。結(jié)論:1、隨著HSC的活化,肝纖維化相關(guān)指標(biāo)Col I和α-SMA的m RNA和蛋白表達(dá)水平均顯著增加。2、miR-34a促進HSC活化,miR-34a功能抑制后可抑制HSC活化。3、Acsl1抑制HSC活化,Acsl1基因沉默可促進HSC活化。4、miR-34a通過靶向Acsl1在HSC表型調(diào)控中發(fā)揮其促肝纖維化功能,參與肝纖維化進程。
【關(guān)鍵詞】：miR-34a 肝纖維化 HSC miR-34a ACSL1 靶基因 肝纖維化 HSC miR-34a ACSL1 HSC表型 肝纖維化指標(biāo)
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 摘要5-11
• Abstract11-16
• 縮略詞表16-17
• 前言17-19
• 第一部分 miR-34a在肝纖維化進程中的表達(dá)及功能研究19-39
• 材料與方法19-30
• 實驗結(jié)果30-35
• 討論35-39
• 第二部分 miR-34a靶基因的篩選與驗證39-64
• 材料與方法39-50
• 實驗結(jié)果50-61
• 討論61-64
• 第三部分 miR-34a靶向Acsl1參與HSC活化增殖的相關(guān)研究64-84
• 材料與方法64-69
• 實驗結(jié)果69-80
• 討論80-84
• 全文總結(jié)84-85
• 參考文獻85-93
• 綜述93-119
• 參考文獻102-119
• 研究生期間發(fā)表論文和參加科研工作情況119-121
• 致謝121-122

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Wen-Ce Zhou;Quan-Bao Zhang;Liang Qiao;;Pathogenesis of liver cirrhosis[J];World Journal of Gastroenterology;2014年23期

2 Catherine M Greene;Robert B Varley;Matthew W Lawless;;MicroRNAs and liver cancer associated with iron overload:Therapeutic targets unravelled[J];World Journal of Gastroenterology;2013年32期

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本文編號：1082530