本文關(guān)鍵詞：厚殼貽貝脂質(zhì)提取物對(duì)腸道損傷、潰瘍性結(jié)腸炎以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的影響和其機(jī)理研究

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【摘要】：厚殼貽貝脂質(zhì)提取物(HMLE)是以厚殼貽貝軟體部分為原料,通過(guò)二氧化碳超臨界萃取以及相關(guān)穩(wěn)定化工藝而制得。針對(duì)其功效的研究,目前還局限于其抗關(guān)節(jié)炎方面,而且全部試驗(yàn)仍停留在動(dòng)物模型的水平上,尚未在其他炎癥性疾病模型中探索其抗炎作用和機(jī)理,也未在人體試驗(yàn)層面對(duì)其進(jìn)行功效評(píng)價(jià)。目前HMLE在腸道炎癥性疾病中的功效及機(jī)理研究還未見報(bào)道,因此基于細(xì)胞層面、動(dòng)物層面和臨床層面的系統(tǒng)研究將會(huì)為HMLE的抗炎功效提供更強(qiáng)有力的科學(xué)證據(jù),同時(shí)也將為其應(yīng)用領(lǐng)域的拓展提供理論基礎(chǔ)。為發(fā)掘HMLE的抗炎功效,本文選取潰瘍性結(jié)腸炎做為探索目標(biāo),從經(jīng)典的體外炎癥模型(脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型)開始探索,并著重觀察其對(duì)與腸道疾病極其相關(guān)的TLR4/NF-κB通路的調(diào)控作用,繼而在LPS攻毒致小鼠腸道損傷模型中探索其對(duì)腸道屏障的保護(hù)作用及其機(jī)理,最后再推進(jìn)至小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中驗(yàn)證其功效并探索其作用機(jī)理,以期發(fā)掘其在潰瘍性結(jié)腸炎的預(yù)防與治療方面的潛力。此外,為補(bǔ)充]HMLE抗關(guān)節(jié)炎功效在人體研究上的缺乏,本文通過(guò)篩選納入類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者,進(jìn)行臨床試食研究,以評(píng)價(jià)HMLE對(duì)該疾病患者臨床癥狀改善的功效。其主要研究結(jié)果如下：(1)在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥模型中,摸索出HMLE在0-125 μg/mL濃度范圍內(nèi)無(wú)細(xì)胞毒性,且展現(xiàn)出良好的抑制一氧化氮(NO)釋放、調(diào)節(jié)促炎／抗炎因子平衡以及下調(diào)TLR4/NF-κB通路中關(guān)鍵信號(hào)分子TLR4和MyD88基因表達(dá)的作用,并最終抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化。顯示出在腸道保護(hù)和腸道炎癥性疾病方面的研究應(yīng)用潛力。(2)在LPS攻毒所致小鼠腸道損傷模型中,HMLE和魚油灌胃增補(bǔ)6周,可顯著提升小鼠紅細(xì)胞磷脂脂肪酸組成中EPA和DHA的比例。并且HMLE和魚油均展現(xiàn)出良好的腸道保護(hù)作用,可顯著改善小鼠回腸絨毛長(zhǎng)度與隱窩深度的比值、緩解反映中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度的結(jié)腸組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性的提升、緩解反映結(jié)腸組織損傷的血清二胺氧化酶(DAO)活性升高和結(jié)腸黏膜DAO活性降低、上調(diào)構(gòu)成腸道機(jī)械屏障結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的mRNA表達(dá)；免疫平衡方面,HMLE和魚油均可從基因表達(dá)水平和蛋白分泌水平顯著改善由LPS刺激導(dǎo)致的小鼠血清與結(jié)腸組織中免疫平衡的破壞；可顯著下調(diào)LPS刺激導(dǎo)致的TLR4/NF-κB通路中TLR4和MyD88的mRNA表達(dá)的異常升高,但對(duì)其下游的IRAK4和TRAF6的mRNA表達(dá)無(wú)顯著影響,而此并不影響HMLE和魚油對(duì)于該通路終點(diǎn)NF-kB活化的抑制以及對(duì)MAPKs中p38 MAPK. JNK和ERK磷酸化的抑制。為進(jìn)一步在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中研究其抗結(jié)腸炎效果奠定了基礎(chǔ)。(3)在葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)的小鼠慢性潰瘍性結(jié)腸炎模型中,HMLE的灌胃增補(bǔ)可顯著緩解結(jié)腸炎小鼠體重的降低和疾病活動(dòng)指數(shù)的升高,其中HMLE高、中劑量組對(duì)維持小鼠的生存率也有一定效果,且高劑量HMLE對(duì)小鼠體重的維持效果優(yōu)于陽(yáng)性藥物柳氮磺胺吡啶(SASP); HMLE增補(bǔ)和藥物SASP治療均有助于結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織色澤、厚度、長(zhǎng)度、重量、水腫、充血以及局部壞死等疾病指標(biāo)的改善,并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；HMLE增補(bǔ)和藥物SASP治療可顯著改善結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織病理學(xué)評(píng)分,緩解炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、絨毛壞死脫落、腺體水腫及灶點(diǎn)彌漫等病理變化,且HMLE高、中劑量組優(yōu)于HMLE低劑量組；]3MLE增補(bǔ)和藥物SASP治療還可顯著降低結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的氧化應(yīng)激水平、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)蛋白表達(dá)水平及其催化的NO釋放水平、COX-2基因表達(dá)水平及其介導(dǎo)的前列腺素E2 (PGE2)的釋放水平、促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-a的mRNA表達(dá)和蛋白分泌水平,其中HMLE對(duì)氧化應(yīng)激的緩解效果優(yōu)于SASP,且HMLE組內(nèi)呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系；HMLE和藥物SASP均可下調(diào)結(jié)腸炎所引起的TLR4、MyD88、IRAK4和TRAF6的mRNA表達(dá),以及抑制MAPKs通路中p38 MAPK、JNK和ERK的磷酸化,并抑制NF-kB的激活。(4)在為期6個(gè)月針對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的隨機(jī)雙盲試食研究中,HMLE配合藥物可更有效地改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的疾病活動(dòng)評(píng)分和臨床疾病活動(dòng)指數(shù),且無(wú)嚴(yán)重不良事件發(fā)生。無(wú)論是意向性(ITT)分析還是符合方案集(PP)分析,均指示HMLE組與安慰劑對(duì)照組存在顯著的療效差異；相比于安慰劑對(duì)照,HMLE增補(bǔ)對(duì)關(guān)節(jié)疼痛計(jì)數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹計(jì)數(shù)和晨僵時(shí)間等臨床指標(biāo)也有更顯著的改善作用。對(duì)患者血清炎癥因子平衡的調(diào)控方面,試食結(jié)束后所有患者血清TNF-α、IL-1β和PGE2水平均顯著下降,血清IL-10水平則顯著升高,而血清IL-6水平卻無(wú)顯著變化；且TNF-α、IL-10和PGE2水平在試食前后的改善幅度存在顯著的組間差異,HMLE組比安慰劑對(duì)照組的改善效果更為明顯。綜上所述,HMLE在體外細(xì)胞炎癥模型、LPS致小鼠腸道屏障損傷模型、DSS致小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中均顯示出良好的抗炎效果,并可能通過(guò)對(duì)TLR4/MAPKs/NF-kB通路的調(diào)控達(dá)到腸道保護(hù)和緩解潰瘍性結(jié)腸炎癥狀的作用；此外,增補(bǔ)HMLE還對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者具有緩解臨床疾病活動(dòng)度的作用。因此,HMLE有極大的潛力成為預(yù)防和治療潰瘍性結(jié)腸炎以及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的功能性油脂。
【關(guān)鍵詞】：厚殼貽貝脂質(zhì)提取物 腸道損傷 潰瘍性結(jié)腸炎 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 抗炎效果
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R574.62
【目錄】：

• 致謝6-7
• 摘要7-10
• Abstract10-17
• 縮略詞17-20
• 第一章 緒論20-44
• 1.1 貽貝資源概述及研究進(jìn)展20-32
• 1.1.1 國(guó)內(nèi)貽貝資源概況20
• 1.1.2 貽貝軟體部分的營(yíng)養(yǎng)成分及價(jià)值20-23
• 1.1.3 貽貝生物活性物研究進(jìn)展23-29
• 1.1.4 貽貝活性物的提取分離方法研究進(jìn)展29-32
• 1.2 腸道屏障保護(hù)機(jī)理與腸道損傷表現(xiàn)32-34
• 1.2.1 腸道機(jī)械屏障32
• 1.2.2 腸道生物屏障32-33
• 1.2.3 腸道免疫屏障33
• 1.2.4 腸道損傷的表現(xiàn)33-34
• 1.3 貽貝脂質(zhì)提取物與潰瘍性結(jié)腸炎34-40
• 1.3.1 潰瘍性結(jié)腸炎概述34
• 1.3.2 胞因子與潰瘍性結(jié)腸炎34-36
• 1.3.3 TLR4/NF-κB通路與潰瘍性結(jié)腸炎36-38
• 1.3.4 傳統(tǒng)抗炎藥物與潰瘍性結(jié)腸炎的治療38-40
• 1.3.5 貽貝脂質(zhì)提取物與潰瘍性結(jié)腸炎的治療40
• 1.4 貽貝脂質(zhì)提取物與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎40-42
• 1.4.1 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎概述40-41
• 1.4.2 貽貝脂質(zhì)提取物與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療41-42
• 1.5 本課題的研究背景、研究目的和研究?jī)?nèi)容42-44
• 1.5.1 研究背景42
• 1.5.2 研究目的及意義42
• 1.5.3 研究?jī)?nèi)容42-44
• 第二章 貽貝脂質(zhì)提取物在小鼠巨噬細(xì)胞炎癥模型中的抗炎活性探索44-63
• 2.1 引言44
• 2.2 試驗(yàn)材料與儀器44-46
• 2.2.1 主要材料44-45
• 2.2.2 主要試劑45-46
• 2.2.3 主要儀器設(shè)備46
• 2.3 試驗(yàn)方法46-55
• 2.3.1 主要試劑配制46-47
• 2.3.2 RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)47
• 2.3.3 HMLE的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)47-49
• 2.3.4 HMLE對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO釋放量的影響49
• 2.3.5 HMLE對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌量或炎癥介質(zhì)生成量的影響49-50
• 2.3.6 HMLE對(duì)RAW264.7細(xì)胞中TLR4/NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵基因以及iNOS基因表達(dá)的影響50-53
• 2.3.7 HMLE對(duì)RAW264.7細(xì)胞NF-κB激活的影響53-54
• 2.3.8 數(shù)據(jù)處理54-55
• 2.4 結(jié)果與分析55-61
• 2.4.1 HMLE的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)55-57
• 2.4.2 HMLE對(duì)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子分泌量及炎癥介質(zhì)生成量的影響57
• 2.4.3 HMLE對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞NO釋放量以及iNOS基因表達(dá)的影響57-60
• 2.4.4 HMLE對(duì)RAW264.7細(xì)胞TLR4/NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵基因表達(dá)及關(guān)鍵信號(hào)分子激活的影響60-61
• 2.5 討論與小結(jié)61-63
• 第三章 貽貝脂質(zhì)提取物在小鼠腸道損傷模型中對(duì)腸道屏障的影響及其機(jī)理研究63-92
• 3.1 引言63
• 3.2 試驗(yàn)材料與儀器63-66
• 3.2.1 主要材料63-64
• 3.2.2 主要試劑64
• 3.2.3 主要儀器設(shè)備64-66
• 3.3 試驗(yàn)方法與設(shè)計(jì)66-74
• 3.3.1 HMLE油脂的配置與劑量選取66
• 3.3.2 小鼠分組與試驗(yàn)設(shè)計(jì)66-67
• 3.3.3 樣品的采集與預(yù)處理67-68
• 3.3.4 紅細(xì)胞磷脂脂肪酸檢測(cè)68-69
• 3.3.5 組織切片的制備及分析69-71
• 3.3.6 生化指標(biāo)的測(cè)定71-72
• 3.3.7 血清及結(jié)腸組織中炎癥因子的含量測(cè)定72
• 3.3.8 結(jié)腸組織中炎癥因子及TLR4/NF-κB通路關(guān)鍵信號(hào)分子基因表達(dá)的檢測(cè)72-73
• 3.3.9 結(jié)腸組織中TLR4/MAPK/NF-κB通路關(guān)鍵信號(hào)分子蛋白表達(dá)的檢測(cè)73-74
• 3.3.10 數(shù)據(jù)處理74
• 3.4 結(jié)果與分析74-88
• 3.4.1 HMLE對(duì)小鼠體重變化的影響74
• 3.4.2 HMLE干預(yù)對(duì)小鼠紅細(xì)胞磷脂脂肪酸的影響74-76
• 3.4.3 HMLE對(duì)小鼠腸道機(jī)械屏障的保護(hù)作用評(píng)價(jià)76-81
• 3.4.4 HMLE對(duì)小鼠血清及結(jié)腸組織中免疫平衡的調(diào)控81-86
• 3.4.5 HMLE對(duì)小鼠結(jié)腸組織中TLR4/NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵分子mRNA表達(dá)的調(diào)控86-87
• 3.4.6 HMLE對(duì)小鼠結(jié)腸組織中MAPKs及NF-κB信號(hào)通路關(guān)鍵分子蛋白活化的調(diào)控87-88
• 3.5 討論與小結(jié)88-92
• 第四章 貽貝脂質(zhì)提取物在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中對(duì)病情的影響及其機(jī)理研究92-120
• 4.1 引言92
• 4.2 試驗(yàn)材料與儀器92-93
• 4.2.1 主要材料92-93
• 4.2.2 主要試劑93
• 4.2.3 主要儀器設(shè)備93
• 4.3 試驗(yàn)方法與設(shè)計(jì)93-99
• 4.3.1 HMLE油脂的配置與劑量選取93
• 4.3.2 小鼠分組與試驗(yàn)設(shè)計(jì)93-94
• 4.3.3 疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)評(píng)分94-96
• 4.3.4 樣品的采集與預(yù)處理96
• 4.3.5 組織切片的制備及分析96-97
• 4.3.6 生化指標(biāo)的測(cè)定97-99
• 4.3.7 血清及結(jié)腸組織中炎癥因子的含量測(cè)定99
• 4.3.8 結(jié)腸組織中炎癥因子及TLR4/NF-κB通路關(guān)鍵信號(hào)分子基因表達(dá)的檢測(cè)99
• 4.3.9 結(jié)腸組織中TLR4/MAPK/NF-κB通路關(guān)鍵信號(hào)分子蛋白表達(dá)的檢測(cè)99
• 4.3.10 數(shù)據(jù)處理99
• 4.4 結(jié)果與分析99-115
• 4.4.1 不同干預(yù)處理對(duì)小鼠造模后生存率、體重及疾病活動(dòng)指數(shù)(DAI)的影響99-102
• 4.4.2 小鼠結(jié)腸組織病理觀察結(jié)果102-106
• 4.4.3 不同干預(yù)處理對(duì)小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)變化的影響106-107
• 4.4.4 不同干預(yù)處理對(duì)小鼠結(jié)腸組織氧化應(yīng)激水平及髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性的影響107-108
• 4.4.5 不同干預(yù)處理對(duì)小鼠結(jié)腸組織一氧化氮(NO)釋放及誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)表達(dá)的影響108-109
• 4.4.6 不同干預(yù)處理對(duì)小鼠免疫平衡的影響109-113
• 4.4.7 不同干預(yù)處理對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中TLR4/MAPKs/NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵分子mRNA及蛋白表達(dá)的調(diào)控113-115
• 4.5 討論與小結(jié)115-120
• 第五章 貽貝脂質(zhì)提取物對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者臨床癥狀改善作用的評(píng)價(jià)120-138
• 5.1 引言120
• 5.2 試驗(yàn)材料與儀器120-121
• 5.2.1 主要材料120
• 5.2.2 主要試劑120
• 5.2.3 主要儀器設(shè)備120-121
• 5.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法121-125
• 5.3.1 篩選標(biāo)準(zhǔn)及樣本量確定121
• 5.3.2 試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)121-122
• 5.3.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)測(cè)定與臨床評(píng)價(jià)方法122-125
• 5.3.4 意向性分析(ITT analysis)和符合方案集分析(PP analysis)125
• 5.3.5 數(shù)據(jù)處理125
• 5.4 結(jié)果與分析125-135
• 5.4.1 受試者完成情況及基本數(shù)據(jù)125
• 5.4.2 試食期間的不良反應(yīng)評(píng)價(jià)125-127
• 5.4.3 試食期間膳食營(yíng)養(yǎng)素與能量攝入變化127
• 5.4.4 基于DAS28評(píng)分的疾病活動(dòng)度改善127
• 5.4.5 基于CDAI評(píng)分的臨床疾病指數(shù)改善127-130
• 5.4.6 其他臨床療效指標(biāo)的變化130-133
• 5.4.7 HMLE試食對(duì)于血液脂肪酸組成及炎癥因子變化的影響133-135
• 5.5 討論與小結(jié)135-138
• 第六章 結(jié)論、創(chuàng)新點(diǎn)和研究展望138-140
• 6.1 結(jié)論138
• 6.2 創(chuàng)新點(diǎn)138-139
• 6.3 研究展望139-140
• 參考文獻(xiàn)140-152
• 作者簡(jiǎn)介及在讀期間所取得的科研成果152-

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