本文關(guān)鍵詞：慢性乙型、丙型肝炎患者血清糖蛋白糖鏈譜的研究

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【摘要】：研究背景及意義：慢性乙型、丙型肝炎是關(guān)乎全世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生安全的傳染性疾病。慢性肝炎是由肝炎病毒感染肝臟引起的,導(dǎo)致肝組織損傷和炎癥疾病。病毒感染機(jī)體6個(gè)月后,55%85%急性感染者將轉(zhuǎn)變?yōu)槁愿窝?15%～30%慢性肝炎患者在20～25年后會(huì)發(fā)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌。研究表明在肝臟的炎癥、纖維化、癌變的過程中,患者血清出現(xiàn)糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)和功能的改變,這種變化與肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。慢性肝炎發(fā)生發(fā)展過程中常伴隨有緩慢的肝纖維化進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象是肝纖維化分級(jí)為F0-F1時(shí)期的慢性肝炎患者,篩選慢性乙型、丙型肝炎患者血清特異性變化的糖蛋白糖鏈,具有十分重要的意義。首先,為肝炎的血清學(xué)診斷標(biāo)志物提供新的理論依據(jù),尋找肝纖維化早期診斷標(biāo)志物和治療靶標(biāo)提供理論支撐；其次,為病毒性肝炎的治療提供新的方向,篩選血清中變化的糖鏈后,可進(jìn)一步確定病毒侵染肝細(xì)胞后肝細(xì)胞中相關(guān)糖酶的變化。通過某種高表達(dá)的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶來抑制病毒蛋白的表達(dá),從而起到獨(dú)特地抑制病毒復(fù)制的效果；最后,清楚的了解病毒感染肝臟導(dǎo)致血清糖蛋白糖鏈特異的變化可為研究HBV、HCV慢性感染引發(fā)的癌癥機(jī)制研究提供新的線索。方法：本研究利用凝集素芯片技術(shù)檢測(cè)45例健康志愿者(對(duì)照組)、54例慢性乙型肝炎和57例慢性丙型肝炎(實(shí)驗(yàn)組)患者血清糖蛋白糖鏈譜。篩選兩種肝炎病毒感染肝臟導(dǎo)致患者血清糖蛋白糖鏈的表達(dá)差異,選擇慢性乙肝和慢性丙型肝炎患者血清中凝集素識(shí)別的特異性變化的糖鏈,利用凝集素印跡技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證并推測(cè)差異性表達(dá)糖鏈及其分子機(jī)制。選取慢性乙肝、丙肝患者血清中表達(dá)差異最顯著的糖鏈所對(duì)應(yīng)的凝集素,制備凝集素磁性微粒復(fù)合物,然后利用該復(fù)合物富集分離血清中凝集素識(shí)別的特異性糖蛋白,PNGase F酶解N-糖鏈,基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF/TOF)對(duì)血清中N-連接糖蛋白糖鏈進(jìn)行鑒定和解析,結(jié)合凝集素芯片的結(jié)果推測(cè)得到慢性乙肝、丙肝患者血清中變化的完整糖鏈結(jié)構(gòu)。結(jié)果：1.應(yīng)用凝集素芯片技術(shù)篩選慢性乙肝、丙型肝炎患者血清相對(duì)于健康志愿者血清中差異性表達(dá)的糖蛋白糖鏈,結(jié)果表明慢性乙肝中共15種凝集素(HHL、GSL-Ⅱ、EEL、LEL、GSL-Ⅰ、DBA、LCA、PTL-ⅠI、SBA、VVA、NPA、PSA、UEA-Ⅰ、ACA和PHE-E+L)識(shí)別的糖鏈發(fā)生變化,慢性丙肝中共7種凝集素(SBA、LEL、MAL-Ⅰ、VVA、WGA、DBA和PHA-E+L)識(shí)別的糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。共同變化的有5種凝集素(LEL、SBA、MAL-Ⅰ、VVA和PHA-E+L)識(shí)別的糖鏈發(fā)生變化。2.比較特殊的是,PHA-E+L識(shí)別的bi-antennary、bisecting GlcNAc tri- and tetra-antennary complex-type N-glycan糖鏈結(jié)構(gòu)在混合和個(gè)例樣本中均表現(xiàn)一致的變化,即在慢性乙肝中低表達(dá),慢性丙肝中高表達(dá)。研究表明GnT-Ⅲ參與編碼的平分型N-糖鏈與肝臟疾病密切相關(guān),該糖鏈可被PHA-E+L識(shí)別。因此,選擇凝集素PHA-E+L富集健康志愿者、慢性乙肝和慢性丙肝患者血清中糖蛋白,經(jīng)過SDS-PAGE電泳結(jié)果鑒定,以及第二章凝集素印跡(PHA-E+L)的結(jié)果可以看出,差異性糖蛋白主要表現(xiàn)在分子量在250kDa處的蛋白條帶和55kDa處的蛋白條帶。用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀對(duì)血清中富集到的N-連接糖蛋白糖鏈進(jìn)行鑒定。3.質(zhì)譜結(jié)果,①健康志愿者、慢性乙型肝炎和慢性丙型肝炎患者血清中分別共鑒定到18種、23種,26種糖鏈峰。與健康志愿者相比,慢性乙肝患者中發(fā)生變化的糖鏈峰有m/z為1850.666、1866.465、2037.750、2151.793、2304.835這五種糖鏈峰對(duì)應(yīng)的糖鏈結(jié)構(gòu)。此外,在慢性丙肝患者中除了這五種糖鏈峰對(duì)應(yīng)的糖鏈外,糖鏈峰還有m/z為1460.502、2069.740、2174.772三種糖鏈峰對(duì)應(yīng)的完整糖鏈結(jié)構(gòu)。②慢性丙肝患者血清中PHA-E+L富集到的N-糖鏈種類最多,平分型N-糖鏈占絕大多數(shù)。并且糖鏈末端多為半乳糖和N-L酰半乳糖。③慢性乙肝和慢性丙肝患者中,富集到的N-糖鏈多為二天線(包括平分型)和三天線型,僅出現(xiàn)了一個(gè)四天線型的復(fù)雜N-糖鏈。4.綜合凝集素芯片和質(zhì)譜結(jié)果分析表明,病毒感染肝臟引起血清糖蛋白糖鏈變化異常明顯,慢性乙肝患者血清中主要是末端Gal糖基化減少,隨之增多是末端GalNAc和GlcNAc糖基化結(jié)構(gòu)。慢性丙肝患者血清中,唾液酸化結(jié)構(gòu)、巖藻糖基化以及分支結(jié)構(gòu)的糖鏈明顯增加。
【關(guān)鍵詞】：乙型/丙型肝炎 凝集素芯片 糖蛋白 糖鏈 質(zhì)譜
【學(xué)位授予單位】：西北大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.6
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-9
• 英文縮略表9-13
• 第一章 文獻(xiàn)綜述13-26
• 1.1 糖蛋白研究概述13-18
• 1.1.1 糖蛋白定義及其功能13
• 1.1.2 糖蛋白糖鏈類型及合成13-15
• 1.1.3 糖蛋白富集與分離15-16
• 1.1.4 糖蛋白糖鏈的結(jié)構(gòu)解析16-18
• 1.2 乙型及丙型肝炎概述18-22
• 1.2.1 乙型及丙型肝炎發(fā)現(xiàn)及特點(diǎn)18-19
• 1.2.2 乙型、丙型肝炎病毒致病性19-20
• 1.2.3 慢性乙型、丙型肝炎發(fā)展自然史20-21
• 1.2.4 肝炎與糖基化變化21-22
• 1.3 肝纖維化的研究進(jìn)展22-25
• 1.3.1 肝纖維化及診斷方法22-23
• 1.3.2 肝纖維化糖鏈標(biāo)志物23-24
• 1.3.3 肝纖維化分子機(jī)制與異常糖基化24-25
• 1.4 本課題研究目的與意義25-26
• 第二章 慢性肝炎患者血清糖蛋白糖鏈譜變化的研究26-45
• 2.1 引言26-27
• 2.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器27-29
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材27
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器27-28
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑配制28-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法29-35
• 2.3.1 研究人群和血清收集29
• 2.3.2 血清總蛋白Bradford定量29-30
• 2.3.3 血清總蛋白Cy3熒光標(biāo)記與純化30
• 2.3.4 凝集素芯片檢測(cè)血清樣本30-32
• 2.3.5 SDS-PAGE電泳32-34
• 2.3.6 凝集素印跡34-35
• 2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果35-43
• 2.4.1 血清蛋白的Bradford定量結(jié)果35-36
• 2.4.2 凝集素芯片梯度實(shí)驗(yàn)36-37
• 2.4.3 慢性乙肝、丙肝和健康志愿者混合樣本血清糖蛋白糖鏈譜37
• 2.4.4 慢性乙肝、丙肝和健康志愿者混合樣本血清糖蛋白糖鏈譜的變化37-39
• 2.4.5 個(gè)例樣本驗(yàn)證血清糖蛋白糖鏈譜的變化39-41
• 2.4.6 凝集素印跡驗(yàn)證差異表達(dá)糖鏈41-43
• 2.5 討論43
• 2.6 本章小結(jié)43-45
• 第三章 PHA-E+L富集肝炎患者血清糖蛋白N-糖鏈譜分析45-59
• 3.1 引言45
• 3.2 實(shí)驗(yàn)材料與儀器45-47
• 3.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑與耗材45-46
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)主要儀器46
• 3.2.3 實(shí)驗(yàn)相關(guān)試劑配制46-47
• 3.3 實(shí)驗(yàn)方法47-50
• 3.3.1 凝集素PHA-E+L磁性微粒富集糖蛋白47-48
• 3.3.2 純化糖蛋白的SDS-PAGE鑒定48
• 3.3.3 糖鏈的釋放48
• 3.3.4 糖鏈的純化48-49
• 3.3.5 糖鏈的質(zhì)譜解析49-50
• 3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-57
• 3.4.0 PHA-E+L磁性微粒的偶聯(lián)量的計(jì)算50
• 3.4.1 PHA-E+L富集的糖蛋白SDS-PAGE電泳鑒定50-51
• 3.4.2 PHA-E+L識(shí)別的 N-糖鏈一級(jí)質(zhì)譜全貌圖51-52
• 3.4.3 PHA-E+L識(shí)別的 N-糖鏈一級(jí)質(zhì)譜糖鏈注釋圖52-56
• 3.4.4 PHA-E+L識(shí)別的 N-糖鏈串聯(lián)質(zhì)譜分析圖56-57
• 3.5 討論57
• 3.6 小結(jié)57-59
• 全文總結(jié)59-61
• 參考文獻(xiàn)61-68
• 致謝68-69
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的科研成果69

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 楊剛龍;馬恬然;李錚;;基于超濾膜輔助的糖蛋白全N-連接糖鏈的富集和質(zhì)譜解析(英文)[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2014年04期

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本文編號(hào)：1071657