本文關鍵詞：TNFAIP8L2在肝纖維化中的作用及機制探討

  更多相關文章： 肝纖維化 TNFAIP8L2 LX-2 TGF-β1 Smad

【摘要】：目的近年來,越來越多的國家面臨肝纖維化的困擾,肝纖維化已成為一個重要的全球衛(wèi)生問題,研究并揭示其發(fā)生的確切分子機制成為防治該疾病的重要課題。肝纖維化的形成是一個動態(tài)過程,各種損傷因子刺激機體以后首先引起機體肝組織的炎癥反應,之后炎癥反應激活免疫細胞分泌趨化因子、TGF-β1等細胞因子作用于人的肝星狀細胞,使肝星狀細胞轉(zhuǎn)變成為活化狀態(tài)的肌纖維母細胞,最終使其纖維Ⅰ型和Ⅲ膠原蛋白,蛋白聚糖和糖蛋白等細胞外基質(zhì)增多,形成肝纖維化�，F(xiàn)研究已知,TGF-β1激活的Smad信號通路是引起肝纖維化的經(jīng)典通路,抑制Smad信號通路可以有效阻斷該疾病的發(fā)生。研究并發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控肝纖維化的分子,對揭示肝纖維化形成的分子機制及干預肝纖維化的進展與疾病轉(zhuǎn)歸意義重大。TIPE2 (Tumor necrosis factor-α-induced protein-8-like-2, TNFAIP8L2)即腫瘤壞死因子a誘導蛋白8型2,與TIPE1 (TNFAIP8L1, TNF-α-induced protein 8-like 1)、TIPE (TNFAIP8)、TIPE3 (TNFAIP8L3)同為腫瘤壞死因子α誘導蛋白8家族(TNFAIP8)成員,結構上具有一定的同源序列。作為一個新型的抑炎分子,TIPE2在抑制炎癥反應、維持機體免疫系統(tǒng)的平衡中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。各種原因造成的炎癥反應是引起肝纖維化的病理基礎,因而炎癥反應往往在該疾病中發(fā)揮至關重要的作用。而TIPE2作為一個新型的抑炎分子,是否在肝纖維化過程中發(fā)揮一定的作用,其作用機制如何,目前尚未有文獻報道。為此,本課題利用CCl4誘導TIPE2敲基因(TIPE2-/-)小鼠與野生型C57小鼠建立肝纖維化動物模型,對比研究TIPE2在肝纖維化中的作用,進而利用TGF-β1刺激肝星狀細胞系LX-2細胞,研究TIPE2調(diào)控肝纖維化的分子機制,并探討TIPE2調(diào)控肝纖維化的細胞信號通路,以期明確TIPE2在該疾病中的作用并揭示其機制,為闡明該疾病的發(fā)生機制及臨床利用免疫調(diào)控分子干預治療該疾病奠定一定的實驗基礎。研究方法1.體內(nèi)實驗研究TIPE2在肝纖維化模型中的作用1.1建立肝纖維化模型取6-8周的C57雄性小鼠,將其隨機分為兩組,模型組(n=20)每周兩次腹腔注射給藥(20%四氯化碳溶液,每g體重注射5μl),對照組(n=20)每周兩次腹腔注射給藥(橄欖油,每g體重注射5μl)。在第四周時,眼球取血4000 r/min離心10分鐘后取上清,用流式細胞儀檢測小鼠血清中MCP-1、TNF-α與IL-6等細胞因子的表達水平,用酶標儀與分光光度計檢測AST與ALT的表達,ELISA方法檢測TGF-β1的表達。在第二周與第四周時,小鼠常規(guī)方法處死后PBS灌流,取一份新鮮肝組織留待分子生物學檢測,一份肝組織(經(jīng)福爾馬林固定)制備成病理切片后用HE染色、Masson染色的方法分析其膠原沉淀形成情況,并綜合判斷肝纖維化形成情況。1.2肝纖維化模型組織中TIPE2的表達檢測上述肝組織切片以TIPE2 (JinSiTe,1:200), α-actin (Abcam,1:200), TGF-β1 (Abcam,5μg/ml)為一抗；SP-9000 (ZSGB-BIO)為二抗,免疫組化檢測TIPE2、 α-actin、TGF-β的表達,新鮮肝組織用于western blot檢測TIPE2的表達,統(tǒng)計分析TIPE2表達強度與肝纖維化程度之間的相關性。1.3利用TIPE2-/-小鼠誘導模型驗證TIPE2在肝纖維化中的作用取6-8周齡TIPE2-/-(n=10)小鼠,每周一次腹腔注射5%四氯化碳溶液(每g體重注射10μl)誘導肝纖維化模型,并以野生型C57小鼠為對照。第四周時,眼球取血后離心獲得血清,檢測血清中的MCP-1、TNF-α與IL-6等細胞因子；小鼠常規(guī)方法處死后PBS灌流,將肝組織(經(jīng)福爾馬林固定)制備成病理切片后用Masson染色的方法分析其膠原沉淀形成情況。1.4生存率分析取6-8周齡TIPE2-/-(n=10)小鼠與C57小鼠(n=10),每周兩次腹腔注射給藥(20%四氯化碳溶液,每g體重注射20μl),動態(tài)觀察其生活狀態(tài),并記錄其體重變化及死亡情況,至12周時常規(guī)方法處死小鼠,繪制生存曲線。2.體外實驗2.1 LX-2細胞培養(yǎng)人肝星狀細胞系LX-2細胞(廣州Jennio生物科技有限公司)培養(yǎng)于含10%血清的RIPA1640培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳、濕潤空氣。2.2檢測TIPE2在LX-2細胞中的表達將LX2鋪到6孔板中(4×105個細胞/孔)培養(yǎng)14個小時后對LX2細胞進行不同濃度、不同時間的TGF-β1刺激。以不同濃度(0,2.5,5,10,20ng/ml)的TGF-β1刺激一定時間后,用western blotting與real-time PCR的方法分別在蛋白水平和mRNA水平檢測TIPE2的表達,篩選TGF-β1刺激TIPE2表達的最佳作用濃度,再以篩選出的最佳濃度(10ng/ml)的TGF-β1分別刺激0、12、24、48小時,檢測TIPE2表達以篩選TGF-β1的刺激TIPE2表達的最佳作用時間。2.3在LX-2細胞中研究TIPE2調(diào)控肝纖維化的機制將人LX-2培養(yǎng)于60 mm小皿中(1×106個細胞/ml),貼壁24 h后以Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染TIPE2表達質(zhì)粒pRK5-hTIPE2,通過用western blotting與real-time PCR的方法分別在蛋白水平和mRNA水平檢測α-actin與MMP-2的表達來驗證TIPE2在正常情況下和TGF-β1刺激情況下對肝纖維化的影響。為探討TIPE2在LX-2細胞中的機制,我們在正常表達TIPE2與過表達TIPE2的LX-2細胞中用TGF-β1刺激細胞,western blotting的方法檢測了Smad3、ERK、 IκB與JNK的磷酸化水平。2.4研究TIPE2調(diào)控Smad信號通路是否依賴于Rac1眾所周知,TIPE2是Rac1的抑制分子。為研究TIPE2調(diào)控Smad信號通路是否依賴于Rac1,我們利用了Rac1抑制劑(NSC23766)檢測Smad3的活性。研究結果1.體內(nèi)實驗結果1.1肝纖維化小鼠模型中TIPE2表達顯著上調(diào)用HE與Masson染色的方法分析肝纖維化情況,結果顯示,肝纖維化模型組中炎癥細胞浸潤明顯,肝組織內(nèi)膠原蛋白的沉積較正常對照小鼠的肝組織顯著升高,同時,促肝纖維化分子a-actin顯著升高、抑纖維化分子MMP-2顯著下降,炎癥因子(MCP-1、TNF-α與IL-6)顯著升高。以上結果說明肝纖維化動物模型誘導成功。用免疫組化與western blotting的方法檢測了肝纖維化模型肝組織中TIPE2的表達,結果發(fā)現(xiàn),在肝纖維化模型中TIPE2表達顯著上調(diào),并且TIPE2表達強度與肝纖維化程度之間呈現(xiàn)正相關。此結果說明TIPE2在肝纖維化形成中發(fā)揮重要作用。1.2 TIPE2基因缺失加重肝纖維化用Masson染色的方法對比分析C57與TIPE2-/-小鼠模型中的肝纖維化程度,結果顯示,TIPE2基因缺失后肝纖維化動物模型中肝臟的炎癥明顯較野生型小鼠模型嚴重,膠原蛋白的沉積亦明顯高于C57小鼠。用流式細胞術的方法檢測到TIPE2基因缺失模型小鼠中血清細胞因子水平(MCP-1與TNF-a)也顯著高于C57模型小鼠,此結果說明TIPE2在肝纖維化形成中發(fā)揮保護作用。1.3 TIPE2基因缺失降低小鼠的生存率同時給TIPE2-/-小鼠與C57小鼠腹腔注射同等劑量的四氯化碳誘導肝纖維化形成,對比分析二者的生存率,結果發(fā)現(xiàn),C57小鼠生存率顯著高于TIPE2-/-小鼠。2.體外實驗結果2.1 TIPE2在TGF-β1誘導的LX-2細胞中顯著上調(diào)我們用western blotting與real-time PCR的方法檢測TIPE2在LX-2細胞中的表達情況,結果發(fā)現(xiàn)LX-2細胞中TIPE2在TGF-β1存在時表達顯著上調(diào),且具有時間依賴性與濃度依賴性。2.2 TIPE2在TGF-β1誘導的LX-2細胞中下調(diào)α-actin、上調(diào)MMP-2通過用western blotting與real-time PCR的方法分別在蛋白水平和mRNA水平檢測α-actin與MMP-2的表達來研究TIPE2在該疾病中的調(diào)控機制,結果顯示,在過表達TIPE2的LX-2細胞中,經(jīng)TGF-β1刺激后α-actin顯著下調(diào)、MMP-2顯著上調(diào)。2.3 TIPE2抑制LX-2細胞的Smad3、IκB與JNK信號通路Smad信號通路與NF-κB信號通路在該疾病中具有重要的作用。為探討TIPE2在肝纖維化中的調(diào)控機制,我們用western blotting的方法檢測TIPE2過表達的LX2細胞的Smad3、ERK、IκB與JNK的磷酸化水平。結果顯示,在過表達TIPE2的LX-2細胞中,經(jīng)TGF-β1刺激后Smad3、IκB與JNK的磷酸化水平顯著下調(diào)。2.4 TIPE2調(diào)控Smad信號通路依賴于RaclTIPE2可以通過與Rac結合抑制NF-κB、MAPK細胞信號通路,為探討在肝纖維化中TIPE2是否依賴于Rac1調(diào)控Smad信號通路,我們在轉(zhuǎn)染了TIPE2的LX-2細胞中加入Rac1抑制劑,利用western blotting的方法檢測Smad3的磷酸化水平,結果顯示,TIPE2對Smad3磷酸化水平的抑制作用可以被Rac1抑制劑阻斷。結論1.TIPE2在肝纖維化中發(fā)揮保護作用。2.TIPE2通過Rac1依賴的方式抑制Smad信號通路發(fā)揮抑制肝纖維化的作用。創(chuàng)新點及意義1.提出抗炎蛋白TIPE2在小鼠肝纖維化模型中發(fā)揮保護作用的創(chuàng)新性論斷。2.提出TIPE2通過與Rac1結合抑制Smad信號通路調(diào)控肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。3.目前尚沒有治療肝纖維化的有效方法,研究TIPE2在該疾病中的作用及其機制,可以發(fā)現(xiàn)肝纖維化的新的調(diào)控分子,為臨床治療肝纖維化以及針對肝纖維化的新藥的開發(fā)提供新的思路。
【關鍵詞】：肝纖維化 TNFAIP8L2 LX-2 TGF-β1 Smad
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-18
• 符號說明18-21
• 前言21-23
• 材料與方法23-32
• 實驗結果32-36
• 討論36-39
• 結論39-40
• 附圖40-49
• 參考文獻49-54
• 致謝54-55
• 攻讀學位期間發(fā)表學術論文目錄55-56
• 學位論文評閱及答辯情況表56

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 鄒圣強,齊宗利;91例非老年慢性乙型肝炎肝纖維化的診斷[J];中國基層醫(yī)藥;2001年04期

2 曾民德;肝纖維化的診斷和治療[J];肝臟;2001年S1期

3 田養(yǎng)年,鄧淑玲,張武智;中西醫(yī)結合治療肝纖維化的新進展[J];中國中醫(yī)藥信息雜志;2001年S1期

4 曾民德;肝纖維化的治療及其療效評估[J];中國中西醫(yī)結合雜志;2002年05期

5 謝彥華,劉春榮;基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑與肝纖維化[J];臨床薈萃;2002年08期

6 李清華,戰(zhàn)淑慧,卞魯巖,秦成勇,勞萍;轉(zhuǎn)化生長因子-β_1和纖溶酶原激活物抑制物-1在肝纖維化中的作用及關系[J];中華消化雜志;2004年02期

7 王吉耀;重視肝纖維化的基礎與臨床研究[J];中華醫(yī)學雜志;2005年15期

8 陸倫根,曾民德;肝纖維化的診斷和評估[J];中華肝臟病雜志;2005年08期

9 時昭紅,鄧長生;肝纖維化的防治研究進展[J];國外醫(yī)學(內(nèi)科學分冊);2005年03期

10 劉克洲;侯偉;;肝纖維化的治療策略[J];中國中西醫(yī)結合雜志;2006年01期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 劉勇鋼;盧建華;;瘦素與肝纖維化關系及研究方法探討[A];中華醫(yī)學會病理學分會2009年學術年會論文匯編[C];2009年

2 袁鳳儀;;淺議中西醫(yī)防治肝纖維化的研究[A];貴州省中西醫(yī)結合學會2010年消化系病學術交流會暨非酒精性脂肪肝研究進展學習班資料匯編[C];2010年

3 杜緒勝;;肝纖維化的中西醫(yī)結合研究現(xiàn)狀[A];中國中西醫(yī)結合學會第十六次全國消化系統(tǒng)疾病學術研討會論文匯編[C];2004年

4 趙新顏;王寶恩;賈繼東;;先天性肝纖維化的臨床病理特點[A];中華醫(yī)學會第十二次全國病毒性肝炎及肝病學術會議論文匯編[C];2005年

5 李驥;董培紅;金益輝;盧明芹;潘發(fā)奮;王幫松;陳永平;;維生素D受體基因多態(tài)性與肝纖維化關系初步研究[A];第九次浙江省中西醫(yī)結合肝病學術會議論文匯編[C];2006年

6 張磊;李俊;黃成;呂雄文;金涌;朱鵬禮;;肝纖維化逆轉(zhuǎn)的機制研究[A];第十屆全國生化與分子藥理學術會議論文摘要匯編[C];2007年

7 徐葉進;;胰島素樣生長因子-1在大鼠肝纖維化組織中的表達及意義[A];2012年浙江省醫(yī)學會肝病、感染病學學術年會暨浙江省感染科醫(yī)師學術年會論文集[C];2012年

8 賈繼東;;肝纖維化的發(fā)生機理及治療進展[A];第6屆全國疑難及重癥肝病大會論文集[C];2011年

9 楊從意;陳英杰;程晶;李群;周大橋;;淺談肝纖維化的臨床研究進展[A];中華中醫(yī)藥學會第十三屆內(nèi)科肝膽病學術會議論文匯編[C];2008年

10 郭宇;曾華強;羅時兵;何麗珍;;中西醫(yī)結合診療肝纖維化的幾點思考[A];第十八次全國中西醫(yī)結合肝病學術會議論文匯編[C];2009年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 張昀;肝纖維化可以治療[N];健康報;2005年

2 陳斌;肝纖維化可以逆轉(zhuǎn)嗎？[N];大眾衛(wèi)生報;2007年

3 范又;肝病專家指出治療肝纖維化中醫(yī)藥療效世界領先[N];光明日報;2007年

4 陳黎明;肝纖維化[N];家庭醫(yī)生報;2006年

5 通訊員 陳麗霞邋王懷民 記者 趙鳳華;黃連素可能治肝纖維化[N];科技日報;2008年

6 蔣明邋通訊員 陳麗霞 王懷民;黃連素治療肝纖維化有效果[N];健康報;2008年

7 健康時報記者 劉橋斌;測肝纖維化免穿刺[N];健康時報;2009年

8 解放軍302醫(yī)院肝纖維化無創(chuàng)診療中心 陳國鳳 黃顯斌 整理;肝纖維化檢查進入無創(chuàng)時代[N];健康報;2009年

9 第二軍醫(yī)大學長征醫(yī)院教授 謝渭芬　整理 王根華;阻斷肝纖維化發(fā)展的鏈條[N];健康報;2010年

10 黃丁毅;福瑞股份：肝纖維化專科面對“做大”命題[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2010年

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李俊峰;單采血漿所致慢性HCV感染20年自然史及其鞘脂組學研究[D];蘭州大學;2015年

2 杜靜華;微小RNAs差異表達對非酒精性脂肪性肝炎相關肝纖維化的影響及分子調(diào)控機制研究[D];河北醫(yī)科大學;2016年

3 李紅;探討海珠益肝方從痰論治肝纖維化的作用及機制研究[D];湖北中醫(yī)藥大學;2016年

4 涂曉龍;miR-30和lincRNA-p21調(diào)控肝纖維化的作用機制研究[D];南京大學;2016年

5 朱穎煒;轉(zhuǎn)染TIMP-1-shRNA基因的骨髓間充質(zhì)干細胞治療大鼠肝纖維化[D];蘇州大學;2016年

6 李楊;磁共振T_2~* mapping成像及分子成像評價大鼠肝纖維化的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學;2015年

7 莊燦皇;基于近二十年文獻中醫(yī)藥治療肝纖維化的方藥規(guī)律研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2016年

8 吳鵬;姜黃素對肝纖維化的保護作用及表觀遺傳學機制[D];南京中醫(yī)藥大學;2016年

9 石磊;表皮形態(tài)發(fā)生素在HIV與HCV共感染肝纖維化中的作用及機制[D];中國人民解放軍醫(yī)學院;2016年

10 陳利軍;經(jīng)血干細胞治療肝纖維化及其作用機制[D];浙江大學;2016年

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王靜;2型糖尿病合并肝纖維化等并發(fā)癥的相關危險因素分析[D];新疆醫(yī)科大學;2015年

2 侯龍輝;沙棘籽油對實驗性大鼠肝纖維化肝臟中TIMP-1表達的影響[D];青海大學;2016年

3 李超;Decorin對CCl_4誘導肝纖維化小鼠肝臟TGF-β1、α-SMA表達的影響[D];青海大學;2016年

4 張明曉;丙酮酸乙酯對四氯化碳誘導大鼠肝纖維化保護作用的研究[D];成都醫(yī)學院;2016年

5 宗詠花;丙酮酸乙酯對膽汁淤積性肝纖維化的作用及其機制的研究[D];成都醫(yī)學院;2016年

6 吳靈芝;瞬時彈性成像技術（FibroTouch）對慢性乙型肝炎肝纖維化的診斷價值[D];首都醫(yī)科大學;2016年

7 蘇李娜;常規(guī)肝臟多期動態(tài)增強CT掃描計算肝細胞外體積分數(shù)定量評價肝纖維化的診斷價值[D];蘭州大學;2016年

8 劉曉亞;Arkadia對肝纖維化SnoN蛋白降解作用的體內(nèi)外實驗研究[D];首都醫(yī)科大學;2016年

9 萬穎;組織聲學結構定量技術評估慢乙肝肝臟纖維化分級的研究價值[D];安徽醫(yī)科大學;2016年

10 孔文麗;M2BPGi評估慢性丙型肝炎患者肝纖維化的臨床研究[D];吉林大學;2016年

，

本文編號：1057735