本文關(guān)鍵詞：膽總管結(jié)石患者膽道和阿爾茨海默癥小鼠腸道的宏基因組學研究

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【摘要】：越來越多的證據(jù)表明人體微生物組與人類健康和疾病關(guān)系密切,這些寄居于人體的微生物通過其代謝產(chǎn)物和免疫調(diào)節(jié)作用與宿主相互作用,從能量攝取、新陳代謝、免疫系統(tǒng)發(fā)育等多個方面對宿主產(chǎn)生深遠影響。諸如肥胖、2型糖尿病、炎性腸病等多種疾病均被發(fā)現(xiàn)與人體微生物組有相關(guān)性。近年來,伴隨著新一代高通量測序技術(shù)的高速發(fā)展,宏基因組測序技術(shù)已成為研究微生物群體的重要手段。該技術(shù)避免了如微生物培養(yǎng)技術(shù)、聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)擴增技術(shù)和系統(tǒng)發(fā)生芯片技術(shù)等傳統(tǒng)微生物鑒別技術(shù)存在的不足,實現(xiàn)了大規(guī)模并行測序,測序通量和測序精度更高,其足以描述微生物群體全貌。當前已通過宏基因組測序手段對人類的胃腸道、皮膚、陰道、口腔和鼻腔等多個部位的微生物群體進行了研究,為研究人體微生物組與人類健康和疾病的關(guān)系奠定了基礎。但是,由于樣本采集、數(shù)據(jù)分析等方面的問題,對于某些特定人類疾病的相關(guān)微生物組研究依舊很少,導致我們對相關(guān)微生物組的構(gòu)成、功能及其在疾病發(fā)生發(fā)展過程中作用的認識還不夠深刻�；诤昊蚪M測序手段,本論文第一、二部分將對前人研究極少的膽總管結(jié)石患者膽道微生物菌群進行探索,包括菌群構(gòu)成、新膽道菌發(fā)現(xiàn)、菌群功能基因和膽道菌群同其他上消化道菌群的聯(lián)系。而在第三部分,作為人類微生物組研究的補充,阿爾茨海默癥模型小鼠的腸道微生物組將被初步研究。現(xiàn)有的膽總管結(jié)石患者膽道菌群多依賴于微生物培養(yǎng)和PCR擴增技術(shù)。當前尚無膽總管結(jié)石患者膽道菌群的系統(tǒng)性研究。本論文對15位中國膽總管結(jié)石患者的膽總管膽汁樣本進行全宏基因組鳥槍法(whole-metagenome shotgun,WMS)測序和16S核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA)擴增子測序(簡稱16S測序)分析。這是首次對膽總管膽汁樣本進行的全宏基因組鳥槍法測序研究。平均每個樣本得到了7.29Gbp的WMS測序數(shù)據(jù),經(jīng)過質(zhì)控和比對分析,宿主序列占所有質(zhì)控后序列的百分比均在98%以上,每個樣本包含的細菌序列數(shù)介于593和1,242,270之間�；诰航Y(jié)構(gòu)分析和聚類分析,我們發(fā)現(xiàn)大部分膽總管結(jié)石患者(13/15)依據(jù)腸道菌群的豐度可以聚成兩大類:一類中既包含口腔、呼吸道細菌,也包含腸道細菌,細菌序列占測序數(shù)據(jù)的比例介于0.62%和1.66%之間;另一類中以口腔、呼吸道細菌為主,僅包含兩個腸道細菌,細菌序列比例介于0.0008%和0.056%之間。因此可以看出,在膽汁樣本中,口腔、呼吸道細菌比腸道細菌更為普遍。并且結(jié)合樣本臨床信息,我們發(fā)現(xiàn)這兩個菌群聚類均與病人的發(fā)熱狀態(tài)或經(jīng)內(nèi)鏡逆行性胰膽管造影術(shù)手術(shù)史無關(guān)。此外,結(jié)果表明,膽道菌群具有明顯的個體異質(zhì)性,有許多細菌僅在一位患者(n=77)或兩位患者(n=43)的樣本中出現(xiàn)。WMS測序和16s測序結(jié)果均表明膽汁微生物組的樣本內(nèi)多樣性低于健康人腸道菌群的。借助于wms測序的優(yōu)勢,本研究一次就發(fā)現(xiàn)了13個之前未報道的膽道細菌,比如魚腥味錐形桿菌和纖維化纖維微細菌。這些細菌的基因組覆蓋度介于1%和33.13%之間,大部分是人類口腔細菌和環(huán)境細菌。本研究還從測序數(shù)據(jù)中鑒別出與膽石形成和膽汁耐受相關(guān)的基因,比如編碼β-葡萄糖醛酸酶、磷脂酶和多重耐藥外排泵蛋白的基因。同時,本研究重構(gòu)了膽道菌群的代謝通路,并與健康人腸道菌群的通路譜進行了比較,結(jié)果表明膽汁樣本中炎癥、氧化應激和鞭毛組裝相關(guān)通路豐度上調(diào),但是碳水化合物代謝相關(guān)通路卻表現(xiàn)出不同的變化模式。為了進一步研究膽道細菌的來源,我們接著對6位膽總管結(jié)石患者的膽總管膽汁、十二指腸液、胃液和唾液進行宏基因組分析。基于16srrna擴增子測序,平均每個樣本得到了12,299條高質(zhì)量序列。在23個樣本中一共檢測到1,398個可操作分類單元(operationaltaxonomicunit,otu)。分析結(jié)果表明在膽汁出現(xiàn)的細菌均出現(xiàn)在上消化道中,在門水平鑒定出的7種膽道細菌均能在同一病人的一個或多個上消化道位點中檢測到。在屬水平,膽汁中出現(xiàn)的53個高豐度細菌也均包含在上消化道菌群中�；谙嚓P(guān)性和菌群多樣性指標,本研究把膽道菌群與上消化道各取樣位點的菌群相比,發(fā)現(xiàn)膽道菌群與十二指腸菌群相似度最高。我們還觀察到膽道菌群相對于上消化道菌群出現(xiàn)了不同的變化模式。雖然大部分細菌,比如普氏菌屬、韋榮球菌屬、卟啉單胞菌屬和羅氏菌屬,在膽汁中的豐度明顯降低,但仍有3個腸桿菌科細菌(埃希氏菌屬、克雷伯菌屬和一種未定義細菌)和錐形桿菌屬在膽汁中豐度上升�；�16s測序數(shù)據(jù)功能預測軟件,本研究預測出各取樣位點的代謝通路豐度,比較結(jié)果表明膽道菌群其環(huán)境信息處理能力和細胞活動能力有所增強。此外,涉及到碳水化合物、脂類、氨基酸、核酸、輔助因子和維生素的代謝通路在不同取樣位點出現(xiàn)了豐度差異,表明膽道細菌可能與上消化道細菌擁有不同的能量和營養(yǎng)來源。這些結(jié)果為膽道細菌可能來自腸道細菌的逆行感染提供了直接證據(jù),并且刻畫了膽道環(huán)境可能對細菌施加的選擇性壓力。此外,為了研究阿爾茨海默癥相關(guān)微生物組,本研究還對散發(fā)性阿爾茨海默癥小鼠的腸道菌群進行了宏基因組分析,并且驗證了中藥lw-afc對小鼠認知功能和腸道菌群的影響。morris水迷宮實驗、穿梭箱實驗和新奇物識別實驗等一系列行為學測試實驗表明,疾病組samp8小鼠在空間學習和記憶能力、主動回避反應能力及物體識別記憶能力等方面存在認知功能損害,而lw-afc具有改善阿爾茨海默癥小鼠出現(xiàn)的認知功能障礙的功能�；�16s測序,平均每個樣本得到160,684條原始序列。在這些樣本中,一共檢測到13,727個otu。小鼠腸道菌群的比較表明,用藥組SAMP8小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)與對照組SAMR1小鼠的更類似。在屬分類水平,與對照組SAMR1小鼠相比,疾病組SAMP8小鼠的腸道微生物組中有8個豐度顯著上調(diào)的OTU和12個豐度下調(diào)的OTU。而與未用藥的疾病組SAMP8小鼠相比,用藥組SAMP8小鼠其腸道菌群也有20個具有豐度差異的OTU,其中15個豐度增加,5個豐度下降。在所有的差異OTU中,有13個OTU的豐度被LW-AFC反向調(diào)節(jié),即疾病組SAMP8小鼠相對于SAMR1小鼠豐度增加或降低的OTU,其豐度在用藥組小鼠中分別反向降低或增加。此外,相關(guān)性分析表明,在屬水平,共計有18個屬與小鼠的至少一種認知能力有關(guān),其中有7個屬與所有3種認知能力顯著相關(guān),并且值得注意的是,這7個屬的豐度均被LW-AFC反向調(diào)節(jié)。結(jié)果表明,疾病組SAMP8小鼠相對于對照組小鼠而言其腸道菌群出現(xiàn)了顯著變化,而且LW-AFC可能具有修復這種菌群失調(diào)的能力�？偟膩碚f,本文基于宏基因組測序技術(shù)刻畫了相應疾病狀態(tài)下膽道和腸道微生物組的構(gòu)成和功能,為進一步研究微生物組在疾病發(fā)病中的作用奠定了基礎。主要有以下創(chuàng)新點:本論文首次系統(tǒng)獲得膽總管膽汁菌群構(gòu)成情況,一次就發(fā)現(xiàn)了前人沒有報道過的13種膽道細菌,并發(fā)現(xiàn)了菌群結(jié)構(gòu)存在兩種主要的分型,同時鑒別出菌群功能基因,重構(gòu)菌群代謝通路網(wǎng)絡,這些研究都是前人未曾做過的;首次通過對6位膽總管結(jié)石患者的膽總管膽汁與其他三個上消化道位點的比較,為醫(yī)學界一直爭論的膽道細菌的來源提供了證據(jù),同時初步揭示了膽道環(huán)境對菌群的影響;此外,對阿爾茨海默癥小鼠的腸道菌群的研究表明,疾病組小鼠相對于對照小鼠出現(xiàn)了菌群失調(diào),而且LW-AFC可能具有修復這種菌群失調(diào)的能力,為尋找潛在的藥物靶點提供了線索。結(jié)果表明宏基因組測序技術(shù)在微生物組研究中和臨床診療中具有廣闊的應用前景。
【關(guān)鍵詞】：膽道 腸道 微生物組 宏基因組測序
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575.7;R749.16
【目錄】：

• 縮略語一覽表4-5
• 摘要5-8
• ABSTRACT8-13
• 前言13-19
• 第一部分 膽總管結(jié)石患者膽總管膽汁的宏基因組學研究19-50
• 1.1 研究背景19-21
• 1.2 材料和方法21-36
• 1.3 結(jié)果36-47
• 1.4 討論47-49
• 1.5 小結(jié)49-50
• 第二部分 膽總管結(jié)石患者膽道和上消化道微生物組的比較研究50-68
• 2.1 研究背景50-51
• 2.2 材料和方法51-57
• 2.3 結(jié)果57-65
• 2.4 討論65-67
• 2.5 小結(jié)67-68
• 第三部分 中藥LW-AFC對阿爾茨海默癥小鼠腸道菌群的效應研究68-89
• 3.1 研究背景68-69
• 3.2 材料和方法69-76
• 3.3 結(jié)果76-85
• 3.4 討論85-87
• 3.5 小結(jié)87-89
• 討論與展望89-92
• 總結(jié)92-94
• 參考文獻94-113
• 附錄113-127
• 個人簡歷127-129
• 致謝129

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本文編號：1038421