本文關(guān)鍵詞：羥基酚酮類化合物通過封閉HBV RNaseH抑制HBV DNA復(fù)制

  更多相關(guān)文章： 乙型肝炎病毒 核糖核酸酶H 純化 羥基酚酮 抑制劑 細(xì)胞毒性

【摘要】：背景慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是嚴(yán)重威脅人類健康的一種慢性疾病,世界上每年約有超過一百萬患者死于HBV相關(guān)疾病。HBV是一種逆轉(zhuǎn)錄復(fù)制的嗜肝DNA病毒,一般根據(jù)基因序列不同將其分為8個(gè)基因型(A-H)。目前臨床可用的抗HBV感染藥物主要有干擾素α和核苷(酸)類似物兩大類藥物。干擾素臨床有效率低且存在較多的副作用限制了臨床廣泛應(yīng)用;核苷(酸)類似物能夠?qū)崿F(xiàn)血清表面抗原陰轉(zhuǎn)的比例也僅有3-6%,并且停藥后的高復(fù)發(fā)率,不確切的療程以及逐漸增加的耐藥性等都使其仍然不能成為抗HBV的理想藥物。尋找抗HBV新的治療靶點(diǎn)和開發(fā)與現(xiàn)有藥物不同作用機(jī)制的抗HBV藥物仍然是迫切需要解決的課題。催化HBV逆轉(zhuǎn)錄過程需要病毒編碼的兩個(gè)關(guān)鍵活性酶,即DNA多聚酶和核糖核酸酶H(Ribonuclease H,RNase H),抑制任何一個(gè)都可以抑制HBV DNA的復(fù)制。以DNA多聚酶為靶點(diǎn)的核苷類藥物能夠抑制HBV DNA到臨床檢測下限以下,然而少量殘存的持續(xù)低水平病毒復(fù)制仍然使得難以徹底清除病毒。如果在抑制DNA多聚酶的同時(shí)能抑制RNase H的活性,即有可能最大限度抑制HBV DNA的復(fù)制,為耗竭ccc DNA提供可能。而通過體外純化獲得有活性HBV RNase H成為篩選抗HBV RNase H藥物的關(guān)鍵之一。從眾多的自然和人工化合物中篩選出具有抑制HBV RNase H活性的化合物是開發(fā)藥物的另一關(guān)鍵。大量研究表明多個(gè)托酚酮類化合物對(duì)人類免疫缺陷病毒(HIV)RNase H活性具有較強(qiáng)抑制作用。HBV與HIV同屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒,臨床上已經(jīng)證實(shí)多個(gè)核苷類藥物能夠同時(shí)抑制HIV和HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶,而HBV RNase H和HIV RNase H同屬于核苷酸轉(zhuǎn)移酶超家族,推測部分托酚酮類化合物可能對(duì)HBV RNase H也存在抑制作用。目的探索一種能夠純化出有活性HBV RNase H的方法并建立一種HBV RNase H抑制劑的生化篩選體系;篩選出能夠通過抑制HBV RNase H進(jìn)而抑制HBV DNA復(fù)制的化合物;研究HBV不同基因型對(duì)RNase H活性及RNase H抑制劑敏感性的影響;為開發(fā)新型抗HBV藥物進(jìn)行有益探索。方法1構(gòu)建HBV RNase H和人RNase H1表達(dá)質(zhì)粒。以C端帶His標(biāo)簽的p Trc His2B為骨架,分別克隆插入基因合成編碼優(yōu)化的基因D型和C型HBV RNase H序列作為基因D型(HRHLP-gt.D)和基因C型(HRHLP-gt.C)HBV RNase H表達(dá)質(zhì)粒;以質(zhì)粒p MAL-c5x His為骨架,在MBP下游插入C端帶His標(biāo)簽的基因C型HBV RNase H序列,構(gòu)成N端帶MBP和C端帶His標(biāo)簽的HBV RNase H(MBP gt.C)表達(dá)質(zhì)粒。以質(zhì)粒p Rset B為骨架插入基因合成的N端帶His標(biāo)簽的人RNse H1基因序列構(gòu)成人RNase H1表達(dá)質(zhì)粒。2 RNase H的表達(dá)和純化。把基因重組合成構(gòu)建的HBV RNase H和人RNase H1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化LOBSTR E.coli菌株并進(jìn)行蛋白表達(dá);采用鎳親和層析法進(jìn)行蛋白純化。3蛋白鑒定。SDS-PAGE膠電泳和Western Blot方法鑒定目的蛋白。4 HBV RNase H和人RNase H1酶活性檢測。采用寡核苷酸引導(dǎo)的RNA切割測定法檢測。長264nt的32P標(biāo)記的鴨型HBV RNA(DRF+)與一段長20nt的互補(bǔ)DNA寡核苷酸鏈擬合成部分雙鏈,DRF+雙鏈部分被加入的RNase H降解后成為長短不同的兩段,可以通過變性膠電泳和放射自顯影方法檢測。5托酚酮類化合物對(duì)HBV RNase H和人RNase H1酶活性抑制作用篩選。采用寡核苷酸引導(dǎo)的RNA切割測定法共篩選了51個(gè)托酚酮類化合物,不同濃度的待測化合物加入反應(yīng)體系中,具有抑制作用的化合物可以抑制RNase H把DRF+切割成兩段。通過變性膠電泳和放射自顯影方法檢測切割產(chǎn)物,Image J軟件定量分析切割產(chǎn)物條帶灰度。6托酚酮類化合物對(duì)HBV DNA的抑制作用。采用Hep DES19細(xì)胞檢測HBV DNA的復(fù)制。細(xì)胞接種于6孔板,培養(yǎng)48小時(shí)后加入待測化合物。每天更換新的含待測化合物的培養(yǎng)基。2天后收獲細(xì)胞,提取細(xì)胞內(nèi)HBV核心顆粒中的HBV DNA。Taq Man PCR分別定量檢測HBV DNA正鏈和負(fù)鏈。7 MTT法細(xì)胞毒性檢測。Hep DES19接種于96孔板培養(yǎng);24小時(shí)后加入不同濃度的待測化合物,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每天更換新的含待測化合物的培養(yǎng)基,2天后加入MTT,繼續(xù)培養(yǎng)60分鐘后,溶解代謝產(chǎn)物,570nm波長檢測吸光值。8檢測不同基因型HBV RNase H對(duì)其抑制劑的敏感性。構(gòu)建基因B型、C型和D型共18個(gè)不同序列HBV RNase H表達(dá)質(zhì)粒,鎳親和層析法純化不同序列HBV RNase H;寡核苷酸引導(dǎo)的RNA切割法檢測不同HBV RNase H的活性和同一HBV RNase H抑制劑(托酚酮化合物#46)對(duì)不同HBV RNase H抑制性的差異。結(jié)果1 HRHLP-gt.D和HRHLP-gt.C僅有微量表達(dá),Western blot可以檢測到純化的微量蛋白;MBP gt.C表達(dá)量豐富,SDS-PAGE膠電泳Coomassie染色和Western blot均可檢測到純化的較高純度的目的蛋白。2 HRHLP-gt.D、HRHLP-gt.C和MBP gt.C均顯示出特異性的酶活性。3純化的HBV RNase H酶活性在一定溫度和時(shí)間內(nèi)具有很好的穩(wěn)定性。4所篩選的51個(gè)托酚酮類化合物中,共有8個(gè)化合物只在60μM時(shí)對(duì)基因D型和(或)C型HBV RNase H具有抑制作用;3個(gè)化合物在20μM時(shí)對(duì)基因D型和(或)C型HBV RNase H具有抑制作用;2個(gè)作用最強(qiáng)的化合物(#46和#106)在10μM時(shí)對(duì)基因D型和C型HBV RNase H同時(shí)具有抑制作用。5選取在化合物初篩實(shí)驗(yàn)中對(duì)基因D型和C型HBV RNase H均有較強(qiáng)抑制作用的6個(gè)托酚酮化合物(#46,#106,#107,#110,#112,#113)進(jìn)行IC50測定。結(jié)果顯示有4個(gè)化合物(#46,#106,#107,#110)的IC50值都小于40μM。6選取共35個(gè)托酚酮化合物進(jìn)行對(duì)人RNase H1的作用初篩,其中包括13個(gè)對(duì)HBV RNase H有抑制作用的化合物和12個(gè)對(duì)HBV RNase H沒有抑制作用的化合物。有4個(gè)化合物在10μM時(shí)對(duì)Hu RH1有抑制作用;14個(gè)化合物在60μM或20μM時(shí)對(duì)Hu RH1有抑制作用;17個(gè)化合物在60μM時(shí)對(duì)Hu RH1沒有抑制作用。7托酚酮類化合物在HBV RNase H和Hu RH1之間抑制強(qiáng)弱程度的不同。#46化合物對(duì)Hu RH1的IC50值約為對(duì)HBV RNase H的10-20倍;#106化合物對(duì)Hu RH1的IC50值約為對(duì)HBV RNase H的2倍多;#110和#112對(duì)Hu RH1和HBV RNase H的IC50值接近;而#113化合物對(duì)Hu RH1的IC50值約為對(duì)HBV RNase H的1/4。8檢測的6個(gè)托酚酮化合物對(duì)HBV DNA抑制作用的EC50均低于10μM,其中最好的#110 EC50只有0.34μM;在每個(gè)檢測樣本中的負(fù)鏈DNA合成均沒有抑制或者只有在化合物濃度很高時(shí)才被抑制。計(jì)算這些化合物的治療指數(shù)最高的#110達(dá)到94。9選取對(duì)HBV DNA正鏈具有選擇性抑制作用的6個(gè)羥基酚酮類化合物(#46,#106,#110,#112,#113和#56)進(jìn)行了Hep DES19細(xì)胞毒性檢測。其CC50值介于25μM到79μM之間。10基因B型、C型和D型及同一基因型不同亞型HBV RNase H之間活性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);但是不同基因型HBV RNase H對(duì)同一HBV RNase H抑制劑(#46)的敏感性沒有差異(P0.05)。結(jié)論1通過E.coli表達(dá)和鎳親和層析法可以獲得有活性的多種基因型HBV RNase H。2寡核苷酸引導(dǎo)的RNA切割法可以作為一種低通量HBV RNase H抑制劑體外生化篩選方法。3 HBV RNase H可以作為新的抗HBV藥物靶點(diǎn)。4托酚酮類化合物中的羥基酚酮類化合物能夠通過抑制HBV RNase H而抑制HBV DNA復(fù)制,是一類值得進(jìn)一步研究開發(fā)的新型抗HBV化合物。5不同基因型的HBV RNase H之間活性存在差異;HBV RNase H抑制劑羥基酚酮類化合物#46具有良好的HBV基因型覆蓋性。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 核糖核酸酶H 純化 羥基酚酮 抑制劑 細(xì)胞毒性
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.62
【目錄】：

• 摘要4-8
• Abstract8-15
• 第一章 引言15-20
• 第二章 HBV RNaseH的表達(dá)和純化20-44
• 1 材料和方法21-37
• 2 結(jié)果37-41
• 3 討論41-44
• 第三章 托酚酮類化合物對(duì)HBV RNaseH的抑制作用篩選44-59
• 1 材料和方法45-49
• 2 結(jié)果49-55
• 3 討論55-59
• 第四章 托酚酮類化合物對(duì)HBV DNA復(fù)制的抑制作用59-73
• 1 材料和方法60-66
• 2 結(jié)果66-71
• 3 討論71-73
• 第五章 不同基因型HBV RNaseH活性及對(duì)其抑制劑羥基酚酮類化合物的敏感性73-79
• 1 材料和方法74-75
• 2 結(jié)果75-77
• 3 討論77-79
• 第六章 結(jié)論79-81
• 參考文獻(xiàn)81-91
• 綜述： 乙型肝炎病毒抑制劑研究進(jìn)展91-108
• 參考文獻(xiàn)100-108
• 個(gè)人簡歷、在學(xué)期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文與研究成果108-109
• 致謝109

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