發(fā)布時間：2017-10-15 10:47

  本文關(guān)鍵詞：HBV感染食蟹猴肝細(xì)胞的研究

  更多相關(guān)文章： NTCP HBV 食蟹猴 原代肝細(xì)胞 CRISPR/Cas9

【摘要】：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可誘發(fā)肝炎、肝硬化,甚至肝癌,是嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一。在HBV相關(guān)研究中,研究人員建立了一系列HBV感染的細(xì)胞和動物模型。雖然這些模型極大地推動了HBV致病機(jī)制的研究,并為抗HBV治療藥物的開發(fā)做出了不可磨滅的貢獻(xiàn),但是目前應(yīng)用的HBV感染模型由于缺乏與人類相同的自然感染過程,因此,無論在機(jī)制研究還是藥物開發(fā)應(yīng)用中,都無法完全勝任。研究發(fā)現(xiàn),鈉離子/牛黃膽酸共轉(zhuǎn)運(yùn)多肽(NTCP)是HBV感染肝細(xì)胞的重要功能受體。NTCP迅速成為抗HBV新藥研究的重要靶標(biāo),同時也為研究建立新型的HBV感染模型提供了靶向。實驗研究已證實,表達(dá)人NTCP的HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞可被HBV感染。本課題研究中,為探索人NTCP能否介導(dǎo)HBV感染食蟹猴原代肝細(xì)胞,首先將人NTCP基因克隆到慢病毒包裝載體后包裝成慢病毒;然后借助慢病毒將人NTCP導(dǎo)入HepG2和Huh7細(xì)胞,細(xì)胞DNA和RNA的探針法real-time PCR檢測結(jié)果和蛋白質(zhì)水平的蛋白質(zhì)印跡檢測結(jié)果表明人NTCP可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá);將表達(dá)人NTCP的上述細(xì)胞與HBV共培養(yǎng),細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg的ELISA定量結(jié)果表明,表達(dá)人NTCP的HepG2和Huh7細(xì)胞能夠被HBV感染。然后,將人NTCP基因借助慢病毒導(dǎo)入食蟹猴原代肝細(xì)胞,細(xì)胞DNA和RNA的探針法real-time PCR檢測結(jié)果表明人NTCP不能在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá),可能的原因是食蟹猴NTCP抑制了人NTCP的表達(dá)。最后,借助CRISPR/Cas9技術(shù)敲除食蟹猴NTCP,并再次將人NTCP導(dǎo)入肝細(xì)胞內(nèi),細(xì)胞DNA和RNA的探針法real-time PCR檢測結(jié)果表明在敲除食蟹猴NTCP后,人NTCP可以在肝細(xì)胞內(nèi)表達(dá);然后用HBV感染表達(dá)人NTCP的肝細(xì)胞,細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg的ELISA定量結(jié)果表明,表達(dá)人NTCP的肝細(xì)胞不能被HBV感染。綜上,人NTCP可以介導(dǎo)HBV感染HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞,但是不能介導(dǎo)HBV感染食蟹猴原代肝細(xì)胞,這提示,NTCP發(fā)揮介導(dǎo)HBV感染作用時需要協(xié)同因子的共同作用。
【關(guān)鍵詞】：NTCP HBV 食蟹猴 原代肝細(xì)胞 CRISPR/Cas9
【學(xué)位授予單位】：河北科技師范學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R512.62
【目錄】：

• 縮略詞4-5
• 摘要5-6
• ABSTRACT6-10
• 第一章 緒論10-17
• 1.1 細(xì)胞模型10-12
• 1.1.1 原代肝細(xì)胞模型10-11
• 1.1.2 細(xì)胞系模型11-12
• 1.2 動物模型12-16
• 1.2.1 非人靈長類模型12-13
• 1.2.2 小鼠模型13-14
• 1.2.3 其他模型14-16
• 1.3 本研究的目的、意義和主要研究內(nèi)容16-17
• 1.3.1 本研究的目的、意義16
• 1.3.2 本研究主要研究內(nèi)容16-17
• 第二章 材料與方法17-44
• 2.1 試驗材料17-22
• 2.1.1 獲取HBV血清17
• 2.1.2 細(xì)胞株17
• 2.1.3 引物和基因合成、質(zhì)粒、感受態(tài)細(xì)胞17
• 2.1.4 實驗動物17-18
• 2.1.5 主要儀器設(shè)備18
• 2.1.6 試劑盒18-19
• 2.1.7 主要試劑及配制19-22
• 2.2 試驗方法22-44
• 2.2.1 人NTCP慢病毒載體構(gòu)建及慢病毒包裝22-29
• 2.2.2 人NTCP介導(dǎo)HBV感染HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞29-34
• 2.2.3 食蟹猴原代肝細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)34-35
• 2.2.4 人NTCP介導(dǎo)HBV感染食蟹猴原代肝細(xì)胞35-36
• 2.2.5 靶向食蟹猴NTCP的gRNA活性篩選及相關(guān)慢病毒包裝36-41
• 2.2.6 人NTCP介導(dǎo)HBV感染食蟹猴NTCP敲除的原代肝細(xì)胞41-44
• 第三章 結(jié)果與分析44-60
• 3.1 人NTCP慢病毒載體構(gòu)建及慢病毒包裝44-47
• 3.1.1 人NTCP慢病毒載體構(gòu)建44-45
• 3.1.2 pLKO.1-hNTCP慢病毒包裝45-47
• 3.2 人NTCP介導(dǎo)HBV感染HepG2細(xì)胞和Huh7細(xì)胞47-51
• 3.2.1 人NTCP介導(dǎo)HBV感染HepG2細(xì)胞47-49
• 3.2.2 人NTCP介導(dǎo)HBV感染Huh7細(xì)胞49-51
• 3.3 食蟹猴原代肝細(xì)胞的分離與原代培養(yǎng)51-53
• 3.4 人NTCP介導(dǎo)HBV感染食蟹猴原代肝細(xì)胞53-54
• 3.5 靶向食蟹猴NTCP的gRNA活性篩選及相關(guān)慢病毒包裝54-57
• 3.5.1 NTCP靶點(diǎn)gRNA活性篩選54-55
• 3.5.2 pLV hUbC-Cas9-T2A-GFP-U6-gRNAx慢病毒載體構(gòu)建55-56
• 3.5.3 pLV hUbC-Cas9-T2A-GFP-U6-gRNAx慢病毒包裝56-57
• 3.6 人NTCP介導(dǎo)HBV感染食蟹猴NTCP敲除的原代肝細(xì)胞57-60
• 3.6.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除食蟹猴NTCP基因57-58
• 3.6.2 病毒感染食蟹猴NTCP敲除的原代肝細(xì)胞58-60
• 第四章 討論60-63
• 4.1 慢病毒載體包裝與感染60
• 4.2 食蟹猴原代肝細(xì)胞分離與培養(yǎng)60-61
• 4.3 人NTCP介導(dǎo)HBV感染61-63
• 第五章 總結(jié)63-65
• 參考文獻(xiàn)65-70
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明70-71
• 致謝71

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 吳一遷;瞿永華;;小鼠游離肝細(xì)胞的制備方法[J];上海實驗動物科學(xué);1985年01期

2 盧力心,倫照榮,梁東升;獼猴肝細(xì)胞的分離及培養(yǎng)[J];動物學(xué)雜志;1988年05期

3 ;培養(yǎng)肝細(xì)胞新方法[J];藥物生物技術(shù);1997年02期

4 趙利斌,郝飛;肝細(xì)胞水化狀態(tài)對細(xì)胞某些代謝的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2000年05期

5 羅小玲,梁安民,李力,謝裕安,吳繼寧,匡志鵬;胎牛肝細(xì)胞低分子天然抑瘤物的制備及其抗腫瘤作用[J];中國腫瘤生物治療雜志;2001年02期

6 李保森,辛紹杰,游紹莉,鄒正升,王福生;乳豬肝細(xì)胞的簡易分離獲取[J];透析與人工器官;2002年04期

7 梁安民,謝裕安,羅小玲,李力,吳繼寧,匡志鵬;胎牛肝細(xì)胞低分子天然抑瘤物的生物學(xué)特性及抗腫瘤作用[J];中國腫瘤;2002年06期

8 湯習(xí)鋒,周東耀,康格非;二甲亞砜、尼克酰胺對肝細(xì)胞生長素促肝細(xì)胞增殖的影響[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2002年02期

9 周霖,薛毅瓏,田磊,李雁凌,張佐云;大規(guī)模豬肝細(xì)胞低溫保存方法的建立[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2003年09期

10 李曼妮;蘇先獅;;人肝臟再生增強(qiáng)因子對體外肝細(xì)胞生長的影響[J];臨床肝膽病雜志;2009年05期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 曹磊;張妍;高超;楊軍;;小型灌流式生物反應(yīng)器的構(gòu)建及其在體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的應(yīng)用[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會第三十四屆學(xué)術(shù)年會論文集[C];2014年

2 朱薇;袁愛力;賴卓勝;劉思德;王亞東;;大量豬肝細(xì)胞的聚集培養(yǎng)及功能鑒定[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會第十二次全國消化系統(tǒng)疾病學(xué)術(shù)研討會論文匯編[C];2000年

3 項紅升;李明;劉劍峰;楊巍;;肝細(xì)胞在線快速定性監(jiān)測系統(tǒng)[A];第一屆全國人工肝及血液凈化學(xué)術(shù)年會暨全國人工肝及血液凈化攻關(guān)協(xié)作組成立大會論文集[C];2004年

4 任宏造;;低硒低磷脂豚鼠肝細(xì)胞的電鏡觀察[A];第五次全國電子顯微學(xué)會議論文摘要集[C];1988年

5 賈珍容;邱銀生;王大菊;王程;宮新江;潘學(xué)營;;三種核苷類抗病毒藥物對大鼠原代肝細(xì)胞的毒性研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會獸醫(yī)藥理毒理學(xué)分會第九次學(xué)術(shù)討論會論文與摘要集[C];2006年

6 呂林;王美玲;羅緒剛;張麗陽;;不同錳水平對肉仔雞肝細(xì)胞脂肪合成關(guān)鍵酶的影響[A];安全優(yōu)質(zhì)的家禽生產(chǎn)——第十五次全國家禽學(xué)術(shù)討論會論文集[C];2011年

7 祝哲誠;李濤;謝俊杰;程東峰;申川;沈柏用;彭承宏;;用于生物人工肝的大量豬肝細(xì)胞低溫凍存[A];2013中國器官移植大會論文匯編[C];2013年

8 劉曙正;段廣才;Henrik S.Huitfeldt;;EGF通過TGFα-P53正反饋機(jī)制引起肝細(xì)胞增殖[A];全國腫瘤流行病學(xué)和腫瘤病因?qū)W學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

9 張勇;宋良文;王清明;黃山英;孫麗;尹繼業(yè);王曉民;;肝再生增強(qiáng)因子在肝細(xì)胞中的自分泌研究[A];第六屆全國生物醫(yī)學(xué)體視學(xué)學(xué)術(shù)會議暨第九屆全軍軍事病理學(xué)學(xué)術(shù)會議、第五屆全軍定量病理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2005年

10 顧勁揚(yáng);張悅;施曉雷;諸薛慧;丁義濤;;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞維持原代豬肝細(xì)胞形態(tài)與功能的實驗研究[A];第一屆全國疑難重型肝病大會、第四屆全國人工肝及血液凈化學(xué)術(shù)年會論文集[C];2008年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王小龍;科學(xué)家發(fā)現(xiàn)保護(hù)肝細(xì)胞的蛋白質(zhì)[N];科技日報;2009年

2 鄭屠;實現(xiàn)從干細(xì)胞得到肝細(xì)胞[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2003年

3 王健;骨髓細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞[N];大眾科技報;2007年

4 本報記者 鄭曉春;英國成功實施肝細(xì)胞治療[N];科技日報;2003年

5 記者 王艷紅;成年人骨髓干細(xì)胞培育出肝細(xì)胞[N];新華每日電訊;2000年

6 時仲省 陳建設(shè) 朱武凌;動物實驗證實 骨髓造血干細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞[N];大眾衛(wèi)生報;2002年

7 江西 錢剛　(主任醫(yī)師);肝臟怎樣解毒[N];家庭醫(yī)生報;2009年

8 欣光;移植豬肝細(xì)胞首獲成功[N];華夏時報;2002年

9 陳金偉;“傷肝藥物”知多少(上)[N];中國醫(yī)藥報;2006年

10 紅衛(wèi);肝炎患者不宜食罐頭食品[N];民族醫(yī)藥報;2004年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前6條

1 吳根生;SV40 T介導(dǎo)的人類胚肝上皮細(xì)胞的體外永生化及其機(jī)制探討[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1992年

2 牛勃;大鼠肝氨甲酰磷酸合成酶Ⅰ基因在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1990年

3 郭懷斌;實驗性淋巴瘀滯誘發(fā)家兔肝組織結(jié)構(gòu)病理變化及其與脂肪肝的關(guān)系[D];河北醫(yī)科大學(xué);2014年

4 劉崇忠;供體肝細(xì)胞預(yù)輸注誘導(dǎo)大鼠肝移植免疫耐受及其作用機(jī)制的實驗研究[D];山東大學(xué);2008年

5 李曉波;肝細(xì)胞內(nèi)新的核氧化固醇—3-硫酸-25-羥化膽固醇的生物合成通路、調(diào)節(jié)及功能研究[D];復(fù)旦大學(xué);2007年

6 張弓;EphA7在原發(fā)性肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其體外抑制研究[D];鄭州大學(xué);2010年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 周美齡;COFs對肝細(xì)胞線粒體損傷及能量代謝障礙機(jī)制的研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 王勝男;六價鉻對雞肝功能和抗氧化性能的影響[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

3 劉佳;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過Insig-1泛素化和SCAP調(diào)節(jié)肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝及機(jī)制探討[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

4 楊靜;LCC基生物材料的制備及其與人體肝細(xì)胞生物相容性的研究[D];湖北工業(yè)大學(xué);2015年

5 黃家惠;利福平誘導(dǎo)小鼠脂肪肝及部分作用機(jī)理[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

6 胡越;Snail2和G9a在肝細(xì)胞EMT過程中的作用及機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2016年

7 劉吉云;人參超微粉中人參皂苷對肝細(xì)胞酒精性損傷的保護(hù)作用[D];吉林大學(xué);2016年

8 王博;肝細(xì)胞CUL4B調(diào)控HBV復(fù)制和肝臟免疫微環(huán)境的作用研究[D];山東大學(xué);2016年

9 馬玲玲;PC-B2對AFB_1致L-02細(xì)胞DNA損傷及相關(guān)基因表達(dá)的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2016年

10 史美娜;microRNA-195在肝細(xì)胞L02葡萄糖攝取中的作用及機(jī)制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2016年

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