本文關鍵詞：芳香烴受體-CD36信號路徑在高同型半胱氨酸血癥誘導小鼠肝臟脂肪變性中的作用研究

  更多相關文章： 高同型半胱氨酸血癥 肝細胞 芳香烴受體 脂肪酸 CD36

【摘要】：非酒精性脂肪性肝臟疾病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是目前備受關注的一種疾病狀態(tài),由非酒精因素引起,以肝臟內脂肪堆積為特征,包含了一系列組織學改變,包括肝臟脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。肥胖、2型糖尿病、高脂血癥等是NAFLD的重要危險因素,但NAFLD的發(fā)病機理仍不十分明確。同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是蛋氨酸在體內代謝產生的含硫氨基酸,臨床上血漿同型半胱氨酸濃度升高(15μM)稱為高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,HHcy)。HHcy是心血管疾病、糖尿病、免疫性以及神經退行性疾病的重要危險因素。近年來的研究表明,HHcy與NAFLD的發(fā)病也密切相關。NAFLD病人血漿Hcy的水平高于正常對照人群;高蛋氨酸飲食(High-methionine diet,HMD)喂養(yǎng)小鼠出現(xiàn)HHcy的同時伴有肝臟的脂質沉積。在不同HHcy模型中,已發(fā)現(xiàn)HHcy可致肝臟脂質代謝紊亂,但具體致病機制仍不明確。本課題旨在進一步闡明HHcy誘發(fā)肝臟脂肪變性的分子機制,以期為減輕HHcy引發(fā)的脂肪肝疾病提供新的治療思路和潛在靶點。我們首先用2%(wt/wt)的HMD分別喂養(yǎng)6周齡C57BL/6雄性小鼠4周和8周建立HHcy模型,發(fā)現(xiàn)血漿Hcy的水平顯著增加。肝臟油紅O染色和肝臟脂質抽提結果表明,與正常飲食組相比,HMD喂養(yǎng)的小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的脂質沉積。為了明確HHcy引起肝臟脂肪變性的具體機制,我們檢測了肝臟脂質代謝相關基因的表達,其中參與脂肪酸(Fatty acid,FA)攝取的關鍵基因清道夫受體CD36的mRNA和蛋白質水平在4周HMD喂養(yǎng)時顯著增加并持續(xù)至8周。體外實驗結果顯示,給予原代肝細胞Hcy處理24小時可在誘導肝細胞脂質沉積的同時上調肝細胞CD36的表達。而CD36作為肝細胞對FA攝取的重要膜受體,參與了肝細胞對長鏈FA的攝取。進一步研究發(fā)現(xiàn)Hcy可增加小鼠原代肝細胞對長鏈FA的攝取,siRNA敲減原代肝細胞中CD36的表達則改善Hcy所致肝細胞脂質沉積及FA攝取增加,以上結果表明CD36是HHcy引發(fā)肝臟脂肪變性的早期反應因子。有關CD36表達調控的研究顯示,CD36是多種轉錄因子調控的靶點。為了明確HHcy引起CD36表達上調的機制,我們篩選了參與CD36表達調控并且和肝臟脂質代謝密切相關的轉錄因子及其靶基因的表達。其中,芳香烴受體(Aryl hydrocarbon receptor,AHR)靶基因(Cyp1a1,Cyp1a2,CD36)的表達在HMD喂養(yǎng)4周和8周均明顯增加。此外,在原代肝細胞中用siRNA敲減AHR及其靶基因的表達或使用ahr拮抗劑ch223191抑制ahr的活性,均可明顯抑制hcy誘導的cd36表達上調、肝細胞fa攝取增加和脂質聚積,表明ahr的激活參與了hcy誘導的肝細胞脂質沉積和cd36表達上調。過表達ahr可通過上調cd36的表達誘發(fā)肝臟的脂肪變性。本研究通過染色質免疫共沉淀實驗證實hcy促進了ahr與cd36啟動子區(qū)域的結合;熒光素酶報告基因檢測顯示hcy增加了ahr反應元件的活性,并且此過程是由內源性配體所介導。核受體ahr是由配體激活的轉錄因子。多種花生四烯酸(arachidonicacid,aa)的代謝產物已被證實是ahr的內源性配體。本實驗室的前期研究表明hhcy參與調節(jié)了aa代謝通路關鍵酶的活性。采用aa靶向代謝組學的方法分析發(fā)現(xiàn)脂氧化酶通路的代謝產物lxa4的水平顯著增加,而lxa4是已知的ahr內源性配體。對參與lxa4生物合成和代謝失活基因表達分析發(fā)現(xiàn),hmd顯著下調了lxa4代謝失活酶15-前列腺素氧化13-還原酶1的表達,提示lxa4含量的增加可能由于lxa4的代謝失活被抑制。為了明確lxa4是否在hcy誘導的肝細胞脂質沉積中發(fā)揮了重要作用,我們過表達15-前列腺素氧化13-還原酶1,發(fā)現(xiàn)其明顯抑制了hcy誘導的cd36表達上調、fa攝取增加和脂質沉積;瞬時轉染實驗表明lxa4可與ahr的配體結合域結合,促進ahr轉位入核,增加了ahr反應元件的活性。給予原代肝細胞lxa4處理上調了ahr靶基因cyp1a1,cyp1a2和cd36的表達,增加了肝細胞fa攝取和脂質沉積,而siahr則逆轉了lxa4的上述作用。因此,lxa4以配體依賴方式激活ahr-cd36信號路徑,參與hcy致肝臟脂質代謝紊亂的過程。為了進一步明確ahr在hhcy誘導肝臟脂肪變性中的關鍵作用,我們在hmd喂養(yǎng)c57bl/6小鼠的同時給予ahr拮抗劑ch223191(10mg/kg/day飲水)分別喂養(yǎng)4周和8周,ch223191明顯減輕了hmd喂養(yǎng)引起的肝臟脂質沉積,同時抑制了肝臟中ahr靶基因cyp1a1,cyp1a2和cd36的mrna表達。這些結果表明抑制ahr的活性可通過降低cd36的表達保護hmd誘導的肝臟脂肪變性。為了將動物實驗與臨床研究相結合,我們對hhcy與nafld發(fā)病的相關性研究進行了連續(xù)性變量的meta分析,發(fā)現(xiàn)nafld病人血漿hcy水平高于正常對照人群,說明hhcy是nafld發(fā)病的重要危險因素。結論:我們的研究表明,hmd可誘導肝臟脂肪變性的發(fā)生。hhcy增加了aa的代謝產物lxa4的含量,lxa4作為ahr的內源性配體激活了ahr-cd36信號路徑,促進了肝細胞FA攝取和脂質沉積。AHR拮抗劑CH223191可以有效地減輕HHcy誘導的肝臟脂肪變性,為臨床治療提供了潛在的靶點。
【關鍵詞】：高同型半胱氨酸血癥 肝細胞 芳香烴受體 脂肪酸 CD36
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語12-15
• 前言15-19
• 研究現(xiàn)狀、成果15-17
• 研究目的、方法17-19
• 一、HMD喂養(yǎng)誘導肝臟脂肪變性的機制研究19-83
• 1.1 實驗對象和方法19-51
• 1.1.1 實驗動物19
• 1.1.2 實驗試劑19-24
• 1.1.3 主要試劑配制24-34
• 1.1.4 實驗方法34-50
• 1.1.5 統(tǒng)計學分析50-51
• 1.2 實驗結果51-79
• 1.2.1 CD36參與了HMD喂養(yǎng)引起的肝臟脂肪變性51-60
• 1.2.2 AHR激活參與Hcy誘導的肝細胞脂質沉積和CD36表達上調60-67
• 1.2.3 LXA4作為內源性配體參與激活AHR-CD36信號路徑67-75
• 1.2.4 抑制AHR減輕HMD喂養(yǎng)引起的肝臟脂肪變性75-79
• 1.3 討論79-83
• 1.3.1 CD36參與了HHcy誘導的肝臟脂肪變性過程79-80
• 1.3.2 HHcy通過激活AHR轉錄性上調了CD36表達80-81
• 1.3.3 LXA4以配體依賴方式激活了AHR-CD36信號路徑81-82
• 1.3.4 抑制AHR有效減輕了HHcy誘導的肝臟脂肪變性82-83
• 二、關于HHcy和NAFLD相關性的Meta分析83-91
• 2.1 實驗對象和方法83-85
• 2.1.1 對象83
• 2.1.2 文獻納入和排除標準83-84
• 2.1.3 數(shù)據(jù)提取84
• 2.1.4 統(tǒng)計分析84-85
• 2.2 實驗結果85-90
• 2.2.1 HHcy與NAFLD發(fā)病相關性的Meta分析85-90
• 2.3 討論90-91
• 全文結論91-94
• 論文創(chuàng)新點94-95
• 參考文獻95-104
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明104-105
• 綜述 芳香烴受體和非酒精性脂肪性肝臟疾病的研究進展105-124
• 綜述參考文獻116-124
• 致謝124-126
• 個人簡歷126

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 ;Prevalence of nonalcoholic fatty liver among administrative officers in Shanghai:an epidemiological survey[J];World Journal of Gastroenterology;2003年05期

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本文編號：1032729