本文關(guān)鍵詞：芳香烴受體-CD36信號(hào)路徑在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)小鼠肝臟脂肪變性中的作用研究

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【摘要】：非酒精性脂肪性肝臟疾病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是目前備受關(guān)注的一種疾病狀態(tài),由非酒精因素引起,以肝臟內(nèi)脂肪堆積為特征,包含了一系列組織學(xué)改變,包括肝臟脂肪變性、脂肪性肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌。肥胖、2型糖尿病、高脂血癥等是NAFLD的重要危險(xiǎn)因素,但NAFLD的發(fā)病機(jī)理仍不十分明確。同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是蛋氨酸在體內(nèi)代謝產(chǎn)生的含硫氨基酸,臨床上血漿同型半胱氨酸濃度升高(15μM)稱為高同型半胱氨酸血癥(Hyperhomocysteinemia,HHcy)。HHcy是心血管疾病、糖尿病、免疫性以及神經(jīng)退行性疾病的重要危險(xiǎn)因素。近年來的研究表明,HHcy與NAFLD的發(fā)病也密切相關(guān)。NAFLD病人血漿Hcy的水平高于正常對(duì)照人群;高蛋氨酸飲食(High-methionine diet,HMD)喂養(yǎng)小鼠出現(xiàn)HHcy的同時(shí)伴有肝臟的脂質(zhì)沉積。在不同HHcy模型中,已發(fā)現(xiàn)HHcy可致肝臟脂質(zhì)代謝紊亂,但具體致病機(jī)制仍不明確。本課題旨在進(jìn)一步闡明HHcy誘發(fā)肝臟脂肪變性的分子機(jī)制,以期為減輕HHcy引發(fā)的脂肪肝疾病提供新的治療思路和潛在靶點(diǎn)。我們首先用2%(wt/wt)的HMD分別喂養(yǎng)6周齡C57BL/6雄性小鼠4周和8周建立HHcy模型,發(fā)現(xiàn)血漿Hcy的水平顯著增加。肝臟油紅O染色和肝臟脂質(zhì)抽提結(jié)果表明,與正常飲食組相比,HMD喂養(yǎng)的小鼠肝臟出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)沉積。為了明確HHcy引起肝臟脂肪變性的具體機(jī)制,我們檢測(cè)了肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá),其中參與脂肪酸(Fatty acid,FA)攝取的關(guān)鍵基因清道夫受體CD36的mRNA和蛋白質(zhì)水平在4周HMD喂養(yǎng)時(shí)顯著增加并持續(xù)至8周。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,給予原代肝細(xì)胞Hcy處理24小時(shí)可在誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積的同時(shí)上調(diào)肝細(xì)胞CD36的表達(dá)。而CD36作為肝細(xì)胞對(duì)FA攝取的重要膜受體,參與了肝細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)鏈FA的攝取。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Hcy可增加小鼠原代肝細(xì)胞對(duì)長(zhǎng)鏈FA的攝取,siRNA敲減原代肝細(xì)胞中CD36的表達(dá)則改善Hcy所致肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積及FA攝取增加,以上結(jié)果表明CD36是HHcy引發(fā)肝臟脂肪變性的早期反應(yīng)因子。有關(guān)CD36表達(dá)調(diào)控的研究顯示,CD36是多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的靶點(diǎn)。為了明確HHcy引起CD36表達(dá)上調(diào)的機(jī)制,我們篩選了參與CD36表達(dá)調(diào)控并且和肝臟脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子及其靶基因的表達(dá)。其中,芳香烴受體(Aryl hydrocarbon receptor,AHR)靶基因(Cyp1a1,Cyp1a2,CD36)的表達(dá)在HMD喂養(yǎng)4周和8周均明顯增加。此外,在原代肝細(xì)胞中用siRNA敲減AHR及其靶基因的表達(dá)或使用ahr拮抗劑ch223191抑制ahr的活性,均可明顯抑制hcy誘導(dǎo)的cd36表達(dá)上調(diào)、肝細(xì)胞fa攝取增加和脂質(zhì)聚積,表明ahr的激活參與了hcy誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和cd36表達(dá)上調(diào)。過表達(dá)ahr可通過上調(diào)cd36的表達(dá)誘發(fā)肝臟的脂肪變性。本研究通過染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)hcy促進(jìn)了ahr與cd36啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合;熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)顯示hcy增加了ahr反應(yīng)元件的活性,并且此過程是由內(nèi)源性配體所介導(dǎo)。核受體ahr是由配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。多種花生四烯酸(arachidonicacid,aa)的代謝產(chǎn)物已被證實(shí)是ahr的內(nèi)源性配體。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明hhcy參與調(diào)節(jié)了aa代謝通路關(guān)鍵酶的活性。采用aa靶向代謝組學(xué)的方法分析發(fā)現(xiàn)脂氧化酶通路的代謝產(chǎn)物lxa4的水平顯著增加,而lxa4是已知的ahr內(nèi)源性配體。對(duì)參與lxa4生物合成和代謝失活基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn),hmd顯著下調(diào)了lxa4代謝失活酶15-前列腺素氧化13-還原酶1的表達(dá),提示lxa4含量的增加可能由于lxa4的代謝失活被抑制。為了明確lxa4是否在hcy誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積中發(fā)揮了重要作用,我們過表達(dá)15-前列腺素氧化13-還原酶1,發(fā)現(xiàn)其明顯抑制了hcy誘導(dǎo)的cd36表達(dá)上調(diào)、fa攝取增加和脂質(zhì)沉積;瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明lxa4可與ahr的配體結(jié)合域結(jié)合,促進(jìn)ahr轉(zhuǎn)位入核,增加了ahr反應(yīng)元件的活性。給予原代肝細(xì)胞lxa4處理上調(diào)了ahr靶基因cyp1a1,cyp1a2和cd36的表達(dá),增加了肝細(xì)胞fa攝取和脂質(zhì)沉積,而siahr則逆轉(zhuǎn)了lxa4的上述作用。因此,lxa4以配體依賴方式激活ahr-cd36信號(hào)路徑,參與hcy致肝臟脂質(zhì)代謝紊亂的過程。為了進(jìn)一步明確ahr在hhcy誘導(dǎo)肝臟脂肪變性中的關(guān)鍵作用,我們?cè)趆md喂養(yǎng)c57bl/6小鼠的同時(shí)給予ahr拮抗劑ch223191(10mg/kg/day飲水)分別喂養(yǎng)4周和8周,ch223191明顯減輕了hmd喂養(yǎng)引起的肝臟脂質(zhì)沉積,同時(shí)抑制了肝臟中ahr靶基因cyp1a1,cyp1a2和cd36的mrna表達(dá)。這些結(jié)果表明抑制ahr的活性可通過降低cd36的表達(dá)保護(hù)hmd誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性。為了將動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與臨床研究相結(jié)合,我們對(duì)hhcy與nafld發(fā)病的相關(guān)性研究進(jìn)行了連續(xù)性變量的meta分析,發(fā)現(xiàn)nafld病人血漿hcy水平高于正常對(duì)照人群,說明hhcy是nafld發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素。結(jié)論:我們的研究表明,hmd可誘導(dǎo)肝臟脂肪變性的發(fā)生。hhcy增加了aa的代謝產(chǎn)物lxa4的含量,lxa4作為ahr的內(nèi)源性配體激活了ahr-cd36信號(hào)路徑,促進(jìn)了肝細(xì)胞FA攝取和脂質(zhì)沉積。AHR拮抗劑CH223191可以有效地減輕HHcy誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性,為臨床治療提供了潛在的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：高同型半胱氨酸血癥 肝細(xì)胞 芳香烴受體 脂肪酸 CD36
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語(yǔ)12-15
• 前言15-19
• 研究現(xiàn)狀、成果15-17
• 研究目的、方法17-19
• 一、HMD喂養(yǎng)誘導(dǎo)肝臟脂肪變性的機(jī)制研究19-83
• 1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象和方法19-51
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物19
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑19-24
• 1.1.3 主要試劑配制24-34
• 1.1.4 實(shí)驗(yàn)方法34-50
• 1.1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析50-51
• 1.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-79
• 1.2.1 CD36參與了HMD喂養(yǎng)引起的肝臟脂肪變性51-60
• 1.2.2 AHR激活參與Hcy誘導(dǎo)的肝細(xì)胞脂質(zhì)沉積和CD36表達(dá)上調(diào)60-67
• 1.2.3 LXA4作為內(nèi)源性配體參與激活A(yù)HR-CD36信號(hào)路徑67-75
• 1.2.4 抑制AHR減輕HMD喂養(yǎng)引起的肝臟脂肪變性75-79
• 1.3 討論79-83
• 1.3.1 CD36參與了HHcy誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性過程79-80
• 1.3.2 HHcy通過激活A(yù)HR轉(zhuǎn)錄性上調(diào)了CD36表達(dá)80-81
• 1.3.3 LXA4以配體依賴方式激活了AHR-CD36信號(hào)路徑81-82
• 1.3.4 抑制AHR有效減輕了HHcy誘導(dǎo)的肝臟脂肪變性82-83
• 二、關(guān)于HHcy和NAFLD相關(guān)性的Meta分析83-91
• 2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象和方法83-85
• 2.1.1 對(duì)象83
• 2.1.2 文獻(xiàn)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)83-84
• 2.1.3 數(shù)據(jù)提取84
• 2.1.4 統(tǒng)計(jì)分析84-85
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果85-90
• 2.2.1 HHcy與NAFLD發(fā)病相關(guān)性的Meta分析85-90
• 2.3 討論90-91
• 全文結(jié)論91-94
• 論文創(chuàng)新點(diǎn)94-95
• 參考文獻(xiàn)95-104
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明104-105
• 綜述 芳香烴受體和非酒精性脂肪性肝臟疾病的研究進(jìn)展105-124
• 綜述參考文獻(xiàn)116-124
• 致謝124-126
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷126

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 ;Prevalence of nonalcoholic fatty liver among administrative officers in Shanghai:an epidemiological survey[J];World Journal of Gastroenterology;2003年05期

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本文編號(hào)：1032729