本文關鍵詞：緩解期炎癥性腸病患者存在特征性菌群失調(diào)

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【摘要】：目的：炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD),主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)和克羅恩病(Crohn's disease, CD),病因尚不明確,目前研究認為其發(fā)病機制由環(huán)境因素作用于遺傳易感宿主引起持續(xù)異常的粘膜免疫反應失衡所致,其中腸道環(huán)境中的細菌起到關鍵作用。大量研究報道活動期IBD患者腸道菌群失調(diào),然而,目前尚缺乏緩解期IBD患者微生態(tài)報道。因此,我們研究正常人群和IBD患者的糞便微生態(tài)特點,探討腸道微生態(tài)與IBD發(fā)病的關系。方法：研究對象包括53例健康對照者,52例活動期克羅恩病患者,57例緩解期克羅恩病患者以及64例活動期潰瘍性結(jié)腸炎患者和18例緩解期潰瘍性結(jié)腸炎患者。收集納入研究對象的糞便標本,提取細菌基因組DNA,基于變性梯度凝膠電泳(Denaturaing gradient gel electrophoresis, DGGE)分子指紋圖譜技術及多元變量數(shù)據(jù)分析方法,探究活動期和緩解期炎癥性腸病患者微生態(tài)的組成特點,基于實時定量聚合酶鏈反應驗證PCR-DGGE結(jié)果的可靠性。結(jié)果：對收集的糞便樣本采用PCR-DGGE指紋圖譜方法進行細菌V3區(qū)16S rDNA條帶分離,結(jié)果顯示,IBD患者的腸道菌群結(jié)構與健康人群有顯著差異。首先IBD患者的腸道菌群多樣性顯著下降。其次,這種差異表現(xiàn)為疾病活動期與緩解期均存在種特異性細菌豐度的改變；通過對DGGE圖譜中的DNA條帶位置校正分析后,共獲得72條有效的band-classes,將band-classes轉(zhuǎn)化為相對光強度進行校正分析后,發(fā)現(xiàn)14條差異性band-classes,通過分離、切膠測序,發(fā)現(xiàn)11個差異性band-classes由單一細菌構成。其中,band-class 2.44為馬鈴薯擬桿菌(Bacteroides vulgatus, B. vulgatus); band-classes4.06、4.37、4.57、4.76、4.99/5.99為厚壁菌門中的產(chǎn)丁酸鹽細菌,序列比對分析后分別分配為Eubacterium eligens、Roseburia hominis A2-183、Eubacterium rectale、 Anaerosipes butyraticus、Faecalibacterium prausnitzii; band-classes 6.18、6.32經(jīng)序列比對分析后均為大腸桿菌-志賀菌群(Escherichia coli-Shigella group); band-class 14.71為雙歧桿菌屬中的Bifidobacterium pseudocatenulatum、band-class16.72分配為厚壁菌門中的Collinsella aerofaciens。與健康對照相比,CD患者糞便中band-class 2.44的條帶光強度(P。=1.58×10-5)和數(shù)量(P=0.004)顯著下降,其光強度在緩解期中亦減少(Pc=4.65x 10-6),但其數(shù)量在活動期CD患者中無差異；Band-class 2.44光強度(Pc=0.03)和數(shù)量(P=0.001)在活動期UC患者也明顯減少,緩解期UC患者條帶光強度無統(tǒng)計學差異,但數(shù)量在緩解期UC患者中顯著下降(P=0.015),活動期UC和緩解期UC患者間該細菌數(shù)量上無統(tǒng)計學差異。與健康對照相比,band-class 4.06(Eubacteria eligens, E. eligens)條帶光強度(Pc=9.93×10-5)及數(shù)量(P=8.05×10-12)在活動期CD患者糞便中顯著下降；在緩解期CD患者中,E. eligens條帶光強度差異無統(tǒng)計學意義(Pc=0.07),但其數(shù)量顯著下降(P=1.36×10-7)；活動期CD患者與緩解期CD患者相比,光強度和絕對數(shù)量均無統(tǒng)計差異,且E. eligens的數(shù)量變化與CD疾病活動度負相關。在活動期UC患者糞便中,E. eligens的光強度(Pc=0.3×10-3)和數(shù)量(P=1.47×10-9)亦顯著下降,盡管緩解期E. eligens條帶強度與健康對照相比差異無統(tǒng)計學意義,但其數(shù)量在緩解期UC患者中顯著下降(P=0.006)。與健康對照相比,Band-class 4.37 (Eubacteria rectale, E. rectale)光強度(Pc=1.88×10-7)和數(shù)量(P=1.36×10-5)在活動期CD患者糞便群落中顯著下降：在緩解期CD患者糞便群落DGGE圖譜中,其光強度(Pc=2.76×10-7)和數(shù)量(P=0.018)亦處于較低水平；與活動期CD相比,緩解期CD患者糞便中E. rectale的數(shù)量(P=0.027)有上升趨勢,但仍難達到正常水平。與健康對照比較,E. rectale條帶光強度在活動期UC患者(Pc=5.06×10-13)和緩解期UC患者(Pc=0.017)中均顯著下降,且活動期UC與緩解期UC患者差異無統(tǒng)計學意義；與健康對照相比,其數(shù)量在活動期UC患者中亦顯著減少(P=5.97×105),但在緩解期UC患者中有上升趨勢；活動期與緩解期之間無差異；此外,E.rectale數(shù)量變化水平與UC疾病活動度負相關(τ=-0.388,P=0.63 x 10-4)。與健康對照比較,Band-class 4.57 (Roseburia hominis A2-183,R. hominis A2-183)光強度在活動期CD(Pc=0.008)和緩解期CD患者(Pc=0.01)中均顯著下降,且活動期與緩解期之間無統(tǒng)計學差異；其數(shù)量在活動期CD患者(P=1.55 x 10-16)和緩解期CD患者(P=1.34 x 10-14)亦顯著下降,兩者無統(tǒng)計學差異。在UC患者中,R. hominis A2-183光強度在活動期UC患者(Pc=1.24 x 10-5)和緩解期UC患者(Pc=0.0028)中均顯著下降；其數(shù)量在活動期UC患者(P=1.04 x 10-15)和緩解期UC患者(P=9.70×10-8)中亦顯著下降,且R. hominis數(shù)量變化與UC疾病活動度負相關(τ=-0.550,P=1.39 x 10-8)。Band-classes 4.99和5.99序列比對后均為普拉梭菌(Faecalibacterium prausnitzii, F. prausnitzii)。Band-class 4.99 F. prausnitzii光強度在活動期CD患者(Pc=1.56×10-5)和緩解期CD患者(Pc=0.04)中亦顯著下降；但是,在UC患者中,band-class 4.99光強度與健康對照組的條帶光強度值差異無統(tǒng)計學意義。Band-class 5.99光強度在活動期CD(Pc=0.047)和緩解期CD(Pc=0.048)患者中均下降,且活動期CD患者與緩解期CD患者條帶強度無統(tǒng)計學差異；與健康對照相比,band-class 5.99光強度在UC患者糞便菌落中無統(tǒng)計學差異。F. prausnitzii的數(shù)量在活動期CD患者(P=4.61 x 10-10)和緩解期CD患者中(P=0.002)顯著下降；與健康對照相比,在活動期UC患者中,F. prausnitzii的數(shù)量亦顯著下降(P=0.003),但在緩解期UC中無統(tǒng)計學差異。F. prausnitzii數(shù)量變化水平與CD(τ=-0.502,P=4.50 x 10-6)和UC(τ=-0.429,P=9.43 x 10-6)嚴重程度均相關。序列比對分析發(fā)現(xiàn)band-classes6.18和6.32均為大腸桿菌-志賀菌群(Escherichia coli-Shigella group)。與健康對照相比,band-class 6.18光強度在活動期CD患者(Pc=0.0024)中顯著升高,但在緩解期CD患者中其光強度差異無統(tǒng)計學意義,活動期和緩解期CD光強度無統(tǒng)計學差異；在活動期UC患者中,band-class 6.18檢出率低于健康對照組(Pc=0.005),緩解期UC患者亦無統(tǒng)計學差異,活動期UC患者與緩解期UC患者條帶光強度中位數(shù)無統(tǒng)計學差異。與健康對照組比較,band-class 6.32光強度在活動期UC患者(Pc=0.9×10-3)和緩解期UC患者(Pc=0.0068)中均升高,且活動期UC患者和緩解期UC患者band-class 6.32光強度無統(tǒng)計學差異,但CD患者中無統(tǒng)計學差異。與健康對照相比,Escherichia coli-Shigella group的數(shù)量在活動期CD患者糞便中(P=1.08×10-6)顯著增加；在緩解期CD患者糞便樣本中,其數(shù)量仍高于健康對照組(P=9.50×10-14)；其數(shù)量在活動期與緩解期CD中無統(tǒng)計學差異。在UC患者中,大腸桿菌群數(shù)量亦顯著增加,尤其以活動期UC患者明顯(P=1.06×10-7),緩解期UC患者糞便中大腸桿菌群數(shù)量較健康對照顯著增加(P=0.03)；但與活動期患者相比,緩解期UC患者腸道中Escherichia coli-Shigella group的絕對數(shù)量有下降趨勢,但兩者無統(tǒng)計學差異。結(jié)論：IBD患者糞便菌群與健康對照者比較存在顯著差異。活動期與緩解期CD和UC糞便菌群多樣性均顯著下降。活動期IBD患者糞便中存在產(chǎn)丁酸鹽菌群失調(diào),且失調(diào)的產(chǎn)丁酸鹽細菌數(shù)量變化水平與IBD嚴重程度相關,表現(xiàn)為活動期CD患者中失調(diào)的E. eligens和F. prausnitzii數(shù)量變化水平與CD嚴重程度負相關,活動期UC患者中失調(diào)的R. hominis、F. prausnitzii、E. rectale變化水平與UC嚴重程度負相關；CD和UC患者具有相同的失調(diào)特征,均表現(xiàn)為F. prausnitzii數(shù)量減少且與疾病嚴重程度相關；緩解期IBD患者存在特征性菌群失調(diào),表現(xiàn)為E. eligens, R. hominis失調(diào),失調(diào)的產(chǎn)丁酸鹽細菌在疾病緩解期可能難以恢復至正常水平。
【關鍵詞】：糞便微生態(tài) 炎癥性腸病 變性梯度凝膠電泳 16S rDNA
【學位授予單位】：武漢大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R574.62
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 1. 引言14-17
• 2 材料及方法17-67
• 2.1 材料17-20
• 2.1.1 研究對象17-20
• 2.2 實驗儀器20
• 2.3 試劑及耗材20-22
• 2.4 方法22-67
• 2.4.1 標本收集與保存22
• 2.4.2 糞便樣本細菌DNA提取22-23
• 2.4.3 變性梯度凝膠電泳方法分析IBD患者糞便菌群組成23-25
• 2.4.4 細菌16S rDNA V3區(qū)變性范圍的優(yōu)化25-29
• 2.4.5 DGGE Marker制作29-45
• 2.4.6 采用PCR-DGGE方法檢測未知樣本菌落分布45-50
• 2.4.7 DGGE圖譜數(shù)字化分析50-60
• 2.4.8 實時定量驗證差異性條帶60-67
• 3 統(tǒng)計分析67-68
• 4 結(jié)果68-85
• 4.1 健康對照與IBD患者年齡及性別組成分析68
• 4.2 IBD患者菌群多樣性分析68-69
• 4.3 IBD患者菌落組成聚類分析69
• 4.4 差異性band-class分析結(jié)果69-75
• 4.5 基于差異性band-classes分析IBD患者菌群自然組成75
• 4.6 差異性band-classes條帶單一性分析結(jié)果75
• 4.7 差異性band-class序列比對分析75-80
• 4.8 定量PCR驗證差異性Band-class80-83
• 4.9 細菌數(shù)量變化與疾病活動度相關分析83-85
• 5 討論85-90
• 6 結(jié)論90-91
• 附表1 多樣性指數(shù)91-96
• 附表2 差異性band-classes光強度值96-105
• 參考文獻105-111
• 攻博期間發(fā)表論著111-112
• 綜述112-122
• 參考文獻118-122
• 致謝122

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