本文關(guān)鍵詞：FKBP51在小鼠肝臟纖維化中的作用以及分子機(jī)制的探究

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【摘要】：[目的]肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化、肝癌發(fā)展的必經(jīng)階段,是所有慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)。雖然肝纖維化發(fā)病率高,但目前對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,且無有效的根本的抗纖維化治療藥物。本論文第一部分通過創(chuàng)建FKBP51基因敲除小鼠肝臟纖維化模型,研究FKBP51在肝臟纖維化中的作用,以期尋找預(yù)防和治療肝臟纖維化的新的靶點(diǎn)。[方法]通過創(chuàng)建FKBP51基因敲除(KO)小鼠肝臟纖維化模型,分析FKBP51基因的缺失對(duì)肝臟的影響。1) FKBP51基因敲除小鼠的肝臟纖維化模型創(chuàng)建。將實(shí)驗(yàn)小鼠分為四組,分別為注射橄欖油的野生型(WT)小鼠(WT-Con)、注射橄欖油的FKBP51基因敲除小鼠(KO-Con)、注射四氯化碳的野生型小鼠(WT-CCL4)、注射四氯化碳的FKBP51基因敲除小鼠(KO-CCL4),腹腔注射,每周三次,持續(xù)兩周；2)肝臟表觀病理觀察。對(duì)肝臟取材后觀察四組肝臟的色澤、質(zhì)地以及表面光滑度；3)肝臟病理學(xué)分析。對(duì)四組小鼠肝臟切片,分別進(jìn)行HE染色,Masson染色,纖維化程度分析,來研究WT和KO小鼠肝臟組織病理學(xué)變化；4)利用Real-time實(shí)驗(yàn),對(duì)與肝臟纖維化相關(guān)的分子進(jìn)行檢測(cè)；5)免疫組化實(shí)驗(yàn)。對(duì)纖維化標(biāo)志分子進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證：6)測(cè)定細(xì)胞凋亡。對(duì)四組小鼠的肝臟切片進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè);7)免疫印跡實(shí)驗(yàn)。對(duì)四組小鼠肝臟組織中的自噬、代謝、TGF-p通路相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)。[結(jié)果]1)通過免疫組織化學(xué)方法鑒定證明成功構(gòu)建了WT和KO肝臟纖維化動(dòng)物模型；2)通過對(duì)肝臟表觀進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)：CCL4處理組中,WT小鼠肝臟色澤暗淡,質(zhì)地硬,表面粗糙,布滿小顆粒纖維化結(jié)節(jié),而FKBP51KO小鼠肝臟色澤較淡,質(zhì)地較硬,表面較粗糙,布滿少量小顆粒纖維化結(jié)節(jié),比野生型小鼠纖維化程度輕；3)肝臟病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)：CCL4處理組中,WT小鼠肝細(xì)胞變性壞死,匯管區(qū)可見大量纖維組織增生且炎癥細(xì)胞多,而FKBP51KO小鼠炎癥細(xì)胞少且膠原沉積少；4)通過Real-time和免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Collagen I、 TIMP1、 CTGF和a-SMA等纖維化標(biāo)志蛋白在FKBP51基因敲除小鼠中的表達(dá)明顯少于野生型小鼠,且與肝臟纖維化Marker相關(guān)的細(xì)胞因子CTGF、 IL6、 INF-Υ、 TGF-β、 TNF-α也出現(xiàn)此趨勢(shì)；5)通過對(duì)WT和KO小鼠肝臟進(jìn)行凋亡測(cè)定實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),FKBP51基因敲除小鼠肝臟凋亡細(xì)胞很少,細(xì)胞中幾乎無胞核固縮、染色質(zhì)邊聚、胞核染成棕黃色等凋亡現(xiàn)象,而野生型小鼠肝臟細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡細(xì)胞：6)免疫印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：FKBP51基因敲除小鼠自噬較WT相比明顯加強(qiáng),而與纖維化相關(guān)的TGF-β中的通路分子在KO小鼠中明顯被抑制。[結(jié)論]FKBP51參與TGF-β通路介導(dǎo)的CCL4誘導(dǎo)的肝臟纖維化過程,FKBP51K0小鼠抵御CCL4誘導(dǎo)的肝臟纖維化。[目的]通過分析野生型小鼠(WT)與Fkbp51基因敲除(KO)小鼠肝臟、海馬RNA表達(dá)譜系之間的差異,研究Fkbp51基因在代謝通路和神經(jīng)通路中的作用。[方法]利用第二代測(cè)序技術(shù)對(duì)Fkbp51KO與WT小鼠的肝臟與海馬mRNA進(jìn)行表達(dá)譜測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果用BRB-ArrayTools進(jìn)行分析,篩選出小鼠肝臟與海馬的差異基因,然后分別利用在線工具DAVID對(duì)差異基因進(jìn)行GO本體分析,STRING數(shù)據(jù)庫對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)的相互作用網(wǎng)絡(luò)分析,并利用Genecard對(duì)基因進(jìn)行注釋。[結(jié)果](1) Fkbp51的缺失,在肝臟中造成類固醇生物合成及代謝、脂類物質(zhì)代謝以及氧化還原反應(yīng)等相關(guān)基因表達(dá)水平的變化：(2)在海馬中造成機(jī)械刺激探測(cè)、學(xué)習(xí)或記憶、突觸傳遞的調(diào)節(jié)、PPAR信號(hào)通路、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(ALS)等相關(guān)基因表達(dá)水平的變化；(3)在肝臟與海馬中,Fkbp51的缺失同時(shí)造成了11個(gè)基因的共差異表達(dá),這11個(gè)基因的蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖顯示：HMGCS2與INSIG1及相關(guān)蛋白形成網(wǎng)絡(luò),而USP2與PER、 CRY、 DBP等相關(guān)蛋白形成另一個(gè)網(wǎng)絡(luò)。這兩個(gè)網(wǎng)絡(luò)既參與代謝也參與神經(jīng)調(diào)節(jié)。[結(jié)論]Fkbp51在代謝與神經(jīng)中的作用既是相互獨(dú)立又是相互聯(lián)系的。
【關(guān)鍵詞】：FKBP51基因敲除小鼠 肝臟纖維化 TGF-β通路 Fkbp51 基因敲除小鼠 肝臟 神經(jīng)系統(tǒng) RNA-seq
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 英文縮略表4-5
• 引言5-6
• 第一部分 Fkbp51在小鼠肝臟纖維化中的作用以及分子機(jī)制的探究6-45
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-16
• 實(shí)驗(yàn)材料16-19
• 實(shí)驗(yàn)方法19-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-42
• 討論42-44
• 結(jié)論44-45
• 第二部分 Fkbp51基因敲除小鼠肝臟與大腦海馬區(qū)RNA表達(dá)譜系的分析比較45-62
• 摘要45-46
• Abstract46-47
• 前言47-48
• 實(shí)驗(yàn)材料48-49
• 實(shí)驗(yàn)方法49-50
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-59
• 討論59-61
• 結(jié)論61-62
• 參考文獻(xiàn)62-66
• 致謝66-67
• 個(gè)人基本情況67-68
• 碩士期間論文發(fā)表情況及學(xué)術(shù)表現(xiàn)68-69

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