發(fā)布時(shí)間：2017-10-07 23:37

  本文關(guān)鍵詞：電刺激促進(jìn)肌衛(wèi)星干細(xì)胞增殖的信號(hào)通路研究

  更多相關(guān)文章： 電刺激 C_2C_(12) 頦舌肌 肌衛(wèi)星細(xì)胞 細(xì)胞增殖 信號(hào)通路

【摘要】：研究背景及意義：阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome,OSAHS)是耳鼻喉科一種常見(jiàn)的睡眠呼吸障礙疾病。咽喉氣道狹窄或者肌肉松弛是其主要原因,患者表現(xiàn)為夜間睡眠過(guò)程中反復(fù)發(fā)生上氣道阻塞或塌陷,導(dǎo)致低通氣或者呼吸暫停,從而引起低氧血癥或者高碳酸血癥等。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,可并發(fā)多種疾病,具有嚴(yán)重的潛在危險(xiǎn)性。既往臨床上治療OSAHS的方法包括手術(shù)及藥物治療,根據(jù)學(xué)者們的研究發(fā)現(xiàn),并非所有的OSAHS患者都可以通過(guò)手術(shù)來(lái)解決問(wèn)題的,Frideman[3]分級(jí)可以有效預(yù)鋇OSAHS患者的手術(shù)結(jié)果從而指導(dǎo)治療,對(duì)于Frideman分級(jí)為I期的患者,手術(shù)療效可以達(dá)到80.6%,II期的患者手術(shù)療效為37.9%,而Ⅲ期的患者手術(shù)療效直接降至8%,故對(duì)于分級(jí)為Ⅲ、Ⅳ期的患者來(lái)說(shuō),手術(shù)是毫無(wú)意義的。那么對(duì)于這一類(lèi)無(wú)法通過(guò)手術(shù)治療的Frideman Ⅲ、Ⅳ期的OSAHS患者來(lái)說(shuō),目前最為推崇的經(jīng)典而有效的方法為持續(xù)氣道正壓通氣(continuous positive airway pressure,CPAP),但是由于CPAP需要患者每晚佩戴面罩并且有噪音等,嚴(yán)重影響患者及家屬的休息,所以即使療效顯著,也依然難以被廣大患者所接受,拒絕接受CPAP治療的患者百分比竟高達(dá)40-50%。直至21世紀(jì)初,隨著對(duì)OSAHS的發(fā)病機(jī)制、解剖學(xué)研究的不斷深入了解及探討,加之實(shí)驗(yàn)室診療設(shè)備的迅猛發(fā)展,舌下神經(jīng)刺激(hypoglossal nervestimulation,HGNS)于2001年開(kāi)始進(jìn)入臨床試驗(yàn),但至今仍未能應(yīng)用于臨床。在更早期,Miki等在20世紀(jì)80年代初就行了相關(guān)研究,他應(yīng)用針刺電極,刺激清醒狀態(tài)下的實(shí)驗(yàn)犬的頦舌肌,并證實(shí),刺激上氣道擴(kuò)張肌能穩(wěn)定及增大咽腔,進(jìn)而達(dá)到治療OSAHS的目的。頦舌肌,是最重要的上氣道擴(kuò)張肌,起于上頦棘,扇形的肌纖維,向后分散,大部分肌纖維止于舌尖、舌背,少量止于舌骨體的前上緣,主要負(fù)責(zé)舌之運(yùn)動(dòng),頦舌肌收縮可牽拉舌體向?qū)?cè)偏移以及向前運(yùn)動(dòng),從而擴(kuò)大咽腔,維持上氣道開(kāi)放,故頦舌肌也被美稱(chēng)為上氣道的“安全肌”。當(dāng)頦舌肌的功能下降,無(wú)法抵抗上氣道吸氣負(fù)壓時(shí),可致口咽氣道塌陷,進(jìn)而引起睡眠呼吸暫�；虻屯�。而頦舌肌雖是骨骼肌,卻又與一般的骨骼肌不盡相同,與其他骨骼肌相比,頦舌肌的血供豐富,肌纖維含量相對(duì)較少,收縮也更迅速,所以更易發(fā)生松弛和疲勞,不適合持續(xù)而強(qiáng)烈的收縮。所以臨床上可以通過(guò)功能性的電刺激頦舌肌,使其規(guī)律收縮,達(dá)到治療OSAHS的目的。目前對(duì)頦舌肌進(jìn)行肌肉電刺激的研究也僅僅限于實(shí)驗(yàn)室,Odeh等對(duì)已麻醉的實(shí)驗(yàn)犬的咽部擴(kuò)張肌進(jìn)行研究后,發(fā)現(xiàn)刺激頦舌肌的機(jī)械效應(yīng)相對(duì)于刺激其他肌肉更顯著,并且與頭位無(wú)關(guān)。Oliven等人則通過(guò)研究發(fā)現(xiàn),刺激舌下神經(jīng)和刺直接刺激犬的頦舌肌所產(chǎn)生的結(jié)果相近。因此,用于治療OSAHS的肌肉起搏器應(yīng)運(yùn)而生。眾所周知功能性電刺激(functional electrical stimulation FES)在其他領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用并獲得成功,如心臟起搏器、膈肌起搏器以及膀胱逼尿肌起搏器等,應(yīng)用于我們耳鼻咽喉科的電刺激器目前主要有喉起搏器,作為一種新興的治療發(fā)展方向,肌肉起搏器是一種功能性肌肉刺激器,起搏后可刺激肌肉并使之恢復(fù)活動(dòng)的技術(shù)。最早由美國(guó)的Zealear與Dedo等人第一次將這個(gè)概念應(yīng)用于我們喉科,在一定的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)上,1996年Zealeal首次將喉起搏器用于人聲帶麻痹的治療,并且他成功證實(shí)了,應(yīng)用于失神經(jīng)支配的狗的環(huán)杓后肌并使之運(yùn)動(dòng)的肌肉起搏器的刺激參數(shù),同樣適用于人的喉內(nèi)肌刺激。隨著肌肉起搏器的應(yīng)用日漸增多,有關(guān)電刺激對(duì)肌肉的影響的研究也越來(lái)越多。肌衛(wèi)星干細(xì)胞作為肌肉再生及修復(fù)的重要來(lái)源,位于基底膜中,與眾多干細(xì)胞一樣,肌衛(wèi)星干細(xì)胞也具有不穩(wěn)定性,在不同參數(shù)的電刺激下,肌衛(wèi)星干細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生分化、增殖或者凋亡,我們前期的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)確定了能夠促進(jìn)衛(wèi)星干細(xì)胞增殖的電刺激參數(shù)。肌衛(wèi)星干細(xì)胞是一種多潛能干細(xì)胞,在骨骼肌的損傷、修復(fù)和維持中起著十分重要的作用。然而正常情況下,肌衛(wèi)星干細(xì)胞是處于靜止?fàn)顟B(tài)的,只有當(dāng)肌肉受到損傷,例如失神經(jīng)支配、缺氧、牽拉或電刺激時(shí),肌衛(wèi)星干細(xì)胞才會(huì)被激活,從而開(kāi)始增殖分化。肌衛(wèi)星干細(xì)胞被激活后開(kāi)始增殖的機(jī)理十分復(fù)雜,電刺激下肌衛(wèi)星干細(xì)胞進(jìn)行增殖是通過(guò)何種信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)節(jié)的目前仍尚未清楚。國(guó)內(nèi)外關(guān)于該方面的研究也較局限。目前體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NO/HGF/c-met通路可能參與其信號(hào)通路,而促進(jìn)肌衛(wèi)星干細(xì)胞增殖的其他細(xì)胞內(nèi)在通路如Wnt通路、Sphingolipid信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路均未見(jiàn)有研究。本研究擬對(duì)以上三個(gè)體外信號(hào)通路進(jìn)行研究,以期發(fā)現(xiàn)一定的電刺激促進(jìn)肌衛(wèi)星干細(xì)胞增殖的主要作用通路,進(jìn)而為臨床肌肉起搏器的研發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。目的：以小鼠肢體來(lái)源的C2C12細(xì)胞系及原代培養(yǎng)的幼年比格犬頦舌肌衛(wèi)星干細(xì)胞為研究對(duì)象,通過(guò)固定電壓、固定刺激時(shí)間、固定脈寬,不同頻率的脈沖電刺激培養(yǎng)細(xì)胞,從而了解不同模式電刺激下C2C12細(xì)胞系以及肌衛(wèi)星干細(xì)胞的增殖和分化情況,進(jìn)一步篩選出肌衛(wèi)星干細(xì)胞的電刺激調(diào)控的增殖信號(hào)通路。方法：1.取體外培養(yǎng)的肌源性C2C12細(xì)胞株, 采用固定電壓(5V)、固定刺激模式、不同頻率(OHz、10Hz、80Hz三組)的串刺激(5s,3s-on,2s-off)刺激細(xì)胞72小時(shí),并提取細(xì)胞RNA,經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄后,運(yùn)用qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)觀(guān)察細(xì)胞增殖情況,從而篩選出電刺激下C2C12細(xì)胞增殖的信號(hào)通路。2.分別用0.25%的胰蛋白酶消化提純以及Percoll密度梯度離心法兩種方法分離提純比格犬頦舌肌原代肌衛(wèi)星干細(xì)胞,并用免疫熒光法分別對(duì)兩組原代培養(yǎng)的肌衛(wèi)星干細(xì)胞進(jìn)行鑒定；采用固定電壓(5V)、固定刺激模式、不同頻率(0Hz、80Hz三組)的串刺激(5s,3s-on,2s-off)刺激肌衛(wèi)星干細(xì)胞72小時(shí),提取細(xì)胞RNA及蛋白,使用qRT-PCR及Western Blot定量／半定量細(xì)胞增殖相關(guān)分子的表達(dá)情況,進(jìn)而篩選出肌衛(wèi)星干細(xì)胞電刺激影響的增殖的信號(hào)通路。2.用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析了解固定刺激電壓、刺激模式,不同刺激頻率的串刺激下,肌衛(wèi)星干細(xì)胞的增殖情況。以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：1.原代培養(yǎng)的比格犬頦舌肌衛(wèi)星干細(xì)胞純度達(dá)80%以上。2.C2C12細(xì)胞系：在固定電壓(5V)、相同脈寬(1ms)、刺激時(shí)間相同的串刺激(5s,3s-on,2s-off)下,刺激頻率為80Hz時(shí), 分化信號(hào)分子MyoD和Myc,Wnt信號(hào)通路中的分子Cyclin D1、rfz、mfz1、mfz2、mfz3、mfz、mfz6、mfz7、 mfz8及Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Wnt8、Wnt10、Wnt11、lef-1、dvl-1等mRNA相對(duì)表達(dá)量減少；而Timp1、Timp3及β-catenin的表達(dá)量相對(duì)增加。10Hz及80Hz時(shí)Notch通路的Notch1、Notch2、Notch3、HERP、DEC的mRNA相對(duì)表達(dá)量增加；Sphingolipid信號(hào)通路Sphk1、Sphk2、Sgp11、Slpr1、Slpr2、Slpr5、cadherin、 Pax7的mRNA相對(duì)表達(dá)量也相應(yīng)增加。3.頦舌肌衛(wèi)星干細(xì)胞：在固定電壓(5V)、相同脈寬(1 ms)、刺激時(shí)間相同的串刺激(5s,3s-on,2s-off)下,刺激頻率為80Hz時(shí),qRT-PCR結(jié)果顯示肌衛(wèi)星干細(xì)胞并未出現(xiàn)增殖；在低頻刺激10Hz時(shí),肌衛(wèi)星細(xì)胞組中,Sphingolipid信號(hào)通路中pax7、sgp11、sgpp1、slpr2、slpr3、slpr4、sphk1、sphk2、cadhenin、的mRNA相對(duì)表達(dá)量相應(yīng)增加。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中Pax7灰度比無(wú)差別；MyoD的灰度0Hz組是最高,其次是80Hz組,最低為10Hz組。結(jié)論：PERCOLL非連續(xù)密度梯度離心法提純的原代培養(yǎng)的比格犬頦舌肌衛(wèi)星干細(xì)胞純度較高。在固定電壓、相同脈寬以及刺激時(shí)間相同的串刺激下,頦舌肌衛(wèi)星細(xì)胞對(duì)高頻、低頻電刺激的反應(yīng)不同于C2C12,后者在低頻、高頻的電刺激時(shí)表現(xiàn)為增殖增加,而前者在低頻、高頻的電刺激下,分化能力減弱；不同頻率的電刺激通過(guò)激活了Wnt、Notch、Sphingolipid等三個(gè)信號(hào)通路使C2C12細(xì)胞進(jìn)入增殖；而在不同頻率電刺激下頦舌肌衛(wèi)星細(xì)胞的總體趨勢(shì)是分化減弱,這可能是低頻刺激時(shí)Notch通路減弱及Sphingolipid增強(qiáng)同時(shí)存在的結(jié)果,高頻電刺激時(shí),頦舌肌衛(wèi)星細(xì)胞分化減弱,是Notch和Sphingolipid通路同時(shí)抑制的結(jié)果。
【關(guān)鍵詞】：電刺激 C_2C_(12) 頦舌肌 肌衛(wèi)星細(xì)胞 細(xì)胞增殖 信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R766
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 材料和方法20-37
• 結(jié)果37-47
• 結(jié)論47-48
• 討論48-53
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 縮略詞對(duì)照表56-58
• 攻讀學(xué)位期間成果58-59
• 綜述59-67
• 參考文獻(xiàn)64-67
• 致謝67-68

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8 盧嘉奕;高頻電刺激指導(dǎo)下的腎動(dòng)脈近段的腎交感神經(jīng)射頻消融術(shù)的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

9 何康;電刺激與電損毀腹外側(cè)視前區(qū)對(duì)大鼠睡眠活動(dòng)的影響[D];河北師范大學(xué);2016年

10 沈偉超;基于電刺激的鯉魚(yú)機(jī)器人腦運(yùn)動(dòng)區(qū)定位及組織學(xué)研究[D];燕山大學(xué);2016年

本文編號(hào)：990774