本文關(guān)鍵詞：先天性小耳畸形相關(guān)差異表達(dá)基因的篩選與驗(yàn)證研究

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【摘要】：目的：通過對先天性小耳畸形殘耳軟骨組織及對側(cè)正常耳軟骨組織的芯片檢測,篩選小耳畸形相關(guān)差異表達(dá)基因,通過生物信息學(xué)分析選擇部分與小耳畸形關(guān)系較密切的基因,通過qRT-PCR和Western blotting方法進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)變化,為深入研究先天性小耳畸形的分子機(jī)制及其防治提供科學(xué)依據(jù)。方法：標(biāo)本源于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院收治的單側(cè)先天性小耳畸形患者�；级鶡o感染及軟骨炎等征象。每例標(biāo)本均于手術(shù)過程中取殘耳軟骨組織(術(shù)中剔除的部分,約100mg)和正常側(cè)(耳顱角較大側(cè))耳軟骨組織(術(shù)中廢棄的部分,約100mg),其中以殘耳軟骨組織為實(shí)驗(yàn)組,正常側(cè)耳軟骨組織為對照組。取材后立即將軟骨組織于液氮中保存或直接提取總RNA和總蛋白。通過美國Agilent公司的Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0篩選單側(cè)先天性小耳畸形患者殘耳軟骨組織(實(shí)驗(yàn)組)和正常側(cè)耳軟骨組織(對照組)的差異表達(dá)基因,根據(jù)生物信息學(xué)分析選擇與小耳畸形更為相關(guān)的ZNF44、Wdr82和FGFR2基因,通過實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)和Western blotting方法進(jìn)一步驗(yàn)證其表達(dá)情況。結(jié)果：1.對照組和實(shí)驗(yàn)組軟骨組織RNA質(zhì)檢結(jié)果顯示：OD260/280值分別1.95、1.86、1.85、1.87、1.88和1.88,28S和18S條帶清晰,無基因組DNA污染。提取的RNA具有良好的完整性和純度。2.從雜交圖上可見密集的cy3綠色熒光呈規(guī)則的圓形,雜交點(diǎn)間沒有重疊現(xiàn)象,信號明顯,圖像背景低,無灰塵噪聲信號。3.芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：先天性小耳畸形軟骨組織中差異表達(dá)基因共553條,其中表達(dá)下調(diào)的基因433條,如鋅指蛋白44 (zinc finger protein 44, ZNF44)基因和WD40重復(fù)蛋白82 (WD40 repeat protein 82, Wdr82)基因分別下調(diào)2.00倍和3.65倍,表達(dá)上調(diào)的基因120條,如成纖維細(xì)胞生長因子2 (fibro-blast growth factor 2, FGF-2)基因上調(diào)2.64倍。這些差異表達(dá)基因涉及胚胎發(fā)育、肢體形成、骨骼發(fā)育及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)事件。4. qRT-PCR方法驗(yàn)證差異表達(dá)基因mRNA水平的表達(dá),結(jié)果顯示：與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組軟骨組織中ZNF44 (t=5.398, P0.01)和Wdr82 (t=5.519, P0.01)基因表達(dá)下調(diào),而FGFR2 (t=4.588, P0.01)基因表達(dá)上調(diào)。與芯片結(jié)果一致。5. Western blotting法驗(yàn)證差異表達(dá)基因蛋白水平的表達(dá),結(jié)果顯示：與對照組相比,實(shí)驗(yàn)組軟骨組織中ZNF44 (t=4.396, P0.05)和Wdr82 (t=6.910, P0.01)基因表達(dá)下調(diào),而FGFR2 (t=13.187,P0.01)基因表達(dá)上調(diào)。與芯片結(jié)果和qRT-PCR結(jié)果一致。結(jié)論：1.小耳畸形殘耳軟骨組織與對側(cè)正常軟骨組織比較,mRNA表達(dá)譜發(fā)生了較大的改變。2. ZNF44、Wdr82和FGFR2等相關(guān)基因參與的生物過程、分子功能、信號通路可能與先天性小耳畸形發(fā)病有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：先天性小耳畸形 差異表達(dá)基因 鋅指蛋白44基因 WD40重復(fù)蛋白82基因 成纖維細(xì)胞生長因子2基因
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R764.7
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• ABSTRACT6-8
• 一、前言8-9
• 二、材料與方法9-22
• 三、結(jié)果22-25
• 四、討論25-28
• 五、結(jié)論28-29
• 附圖29-33
• 參考文獻(xiàn)33-36
• 文獻(xiàn)綜述36-43
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 致謝43-44

【參考文獻(xiàn)】

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1 陳佳鵬;張蕾;陳功;宋新明;鄭曉瑛;;中國1993-1998年出生缺陷監(jiān)測能力分析[J];中華流行病學(xué)雜志;2006年05期

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本文編號：961444