本文關(guān)鍵詞：小鼠誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞移植治療感音神經(jīng)性耳聾的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：研究背景:感音神經(jīng)性耳聾是耳鼻喉科的常見疾病,其主要原因是由內(nèi)耳毛細(xì)胞和/或螺旋神經(jīng)元的損傷導(dǎo)致,然而在哺乳動物,以上二者的損傷是不可能再生與修復(fù)的,因此干細(xì)胞移植替代受損的毛細(xì)胞和/或螺旋神經(jīng)元治療由此引起的感音神經(jīng)性耳聾已成為耳科學(xué)研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)問題。目的:1.通過體外培養(yǎng)建立穩(wěn)定的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞(i PSCs)培養(yǎng)體系;2.利用耳毒性藥物制作小鼠感音神經(jīng)性耳聾模型;3.利用顯微注射法將經(jīng)CM-Di1標(biāo)記的i PSCs經(jīng)圓窗移植入小鼠耳蝸,觀察移植細(xì)胞在耳蝸內(nèi)的存活、遷移、分化情況,為利用i PSCs移植治療感音神經(jīng)性耳聾提供理論依據(jù)。方法:1.i PSCs的培養(yǎng)與標(biāo)記:利用貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)穩(wěn)定傳代的小鼠i PSCs,并用熒光染料CM-Di1標(biāo)記。2.感音神經(jīng)性耳聾模型的制作:利用幼鼠皮下連續(xù)注射新霉素,通過聽性腦干反應(yīng)檢測小鼠聽力損失情況。3.小鼠i PSCs耳蝸移植:取40只造模成功小鼠隨機(jī)平均分為實(shí)驗(yàn)組A和對照組B,同時取20只同批次正常小鼠作為正常組C,A組利用顯微注射法將標(biāo)記的小鼠i PSCs經(jīng)圓窗移植入耳聾鼠耳蝸的Rosenthal’s管中,B組注射等量的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液,4周后處死A、B、C組小鼠各10只,通過免疫熒光染色法和RT-PCR法觀察移植細(xì)胞在耳蝸內(nèi)的存活、遷移與分化情況。剩余小鼠用于ABR閾值的連續(xù)性觀察。4.i PSCs移植后耳蝸HE染色鑒定是否有畸胎瘤形成。結(jié)果:1.成功建立穩(wěn)定的小鼠i PSCs培養(yǎng)體系,并能在體外培養(yǎng)形成EB,RT-PCR可檢測i PSCs多能性基因Nanog,Oct4,Sox2。2.連續(xù)皮下注射新霉素12天后,小鼠反應(yīng)閾達(dá)70-80d Bn HL。3.A組和B組術(shù)后ABR閾值無改善。A組蝸軸和Rosenthal’s管中均可見紅色標(biāo)記的i PSCs,并且部分細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)記物和螺旋神經(jīng)元標(biāo)記物。B、C組耳蝸內(nèi)未見紅色熒光表達(dá)。4.各組小鼠術(shù)前、術(shù)后ABR閾值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。5.HE染色鑒定i PSCs移植后耳蝸暫未見畸胎瘤形成。結(jié)論:1.本實(shí)驗(yàn)可成功建立穩(wěn)定的小鼠i PSCs培養(yǎng)體系。2.CM-Di1可用于體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染和體內(nèi)細(xì)胞的示蹤。3.新霉素可誘導(dǎo)小鼠感音神經(jīng)性耳聾,建立穩(wěn)定的耳聾模型。4.小鼠i PSCs耳內(nèi)移植后可分化為表達(dá)毛細(xì)胞標(biāo)志物的毛細(xì)胞樣細(xì)胞。5.小鼠i PSCs耳內(nèi)移植后可分化為表達(dá)螺旋神經(jīng)元標(biāo)志物的螺旋神經(jīng)元樣細(xì)胞。6.經(jīng)Rosenthal’s管徑路移植i PSCs不能明顯改善耳聾鼠的ABR閾值。7.小鼠i PSCs移植后短期內(nèi)未見畸胎瘤形成。8.移植后的i PSCs主要分布于Rosenthal’s管和蝸軸中。
【關(guān)鍵詞】：誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞 內(nèi)耳移植 毛細(xì)胞 螺旋神經(jīng)元 細(xì)胞分化
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R764.43
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞表10-11
• 第1章 引言11-14
• 第2章 材料與方法14-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料14-18
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動物14
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑14-16
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)主要培養(yǎng)液的配制16-17
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)耗材17-18
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法18-29
• 2.2.1 實(shí)驗(yàn)器材的準(zhǔn)備與實(shí)驗(yàn)分組18-19
• 2.2.2 原代MEF的制備、培養(yǎng)與凍存19-20
• 2.2.3 MEF的復(fù)蘇、傳代和飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備20-21
• 2.2.4 小鼠iPSCs的復(fù)蘇、傳代與凍存21-22
• 2.2.5 小鼠iPSCs的鑒定22-24
• 2.2.6 小鼠iPSCs的分離及CM-Di1的標(biāo)記24
• 2.2.7 小鼠感音神經(jīng)性耳聾模型的制作24
• 2.2.8 術(shù)前及術(shù)后小鼠ABR檢測24-25
• 2.2.9 耳蝸內(nèi)移植CM-Di1標(biāo)記的小鼠iPSCs25
• 2.2.10 耳蝸的免疫學(xué)檢測25-26
• 2.2.11 耳蝸的基因?qū)W檢測26-28
• 2.2.12 移植后耳蝸的HE染色28-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析29-30
• 第3章 結(jié)果30-43
• 3.1 原代MEF的形態(tài)及飼養(yǎng)層細(xì)胞的特點(diǎn)30
• 3.2 小鼠iPSCs的形態(tài)及生長特點(diǎn)30-31
• 3.3 小鼠iPSCs的多能性檢測結(jié)果31-32
• 3.4 CM-Di1標(biāo)記小鼠iPSCs32
• 3.5 ABR檢測結(jié)果及分析32-35
• 3.6 iPSCs在小鼠耳蝸內(nèi)的分化表達(dá)情況35-42
• 3.6.1 耳蝸毛細(xì)胞標(biāo)志物（Myosin7a、Math1、Calretinin）免疫熒光染色結(jié)果35-38
• 3.6.2 耳蝸螺旋神經(jīng)元標(biāo)志物（ Nestin、Neurofliment Medium、Tubulinβ-Ⅲ）免疫熒光染色結(jié)果38-41
• 3.6.3 RT-PCR檢測耳蝸毛細(xì)胞及螺旋神經(jīng)元相關(guān)基因的表達(dá)情況41-42
• 3.7 HE染色鑒定小鼠iPSCs耳蝸內(nèi)移植后的成瘤性42-43
• 第4章 討論43-46
• 第5章 結(jié)論46-47
• 致謝47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果52-53
• 綜述53-59
• 參考文獻(xiàn)58-59

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：957354