發(fā)布時間：2017-09-24 07:38

  本文關(guān)鍵詞：神經(jīng)干細(xì)胞與RPE細(xì)胞的線粒體交換及其對RCS大鼠RPE細(xì)胞線粒體功能影響的研究

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【摘要】：研究背景和目的近年來年齡相關(guān)性黃斑變(age-related macular degeneration,AMD)的發(fā)病率逐年上升,其主要病理改變是視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)細(xì)胞的變性、壞死、丟失。RPE細(xì)胞位于視網(wǎng)膜的最外層,其主要功能包括形成血視網(wǎng)膜屏障、分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子、參與視黃醇循環(huán)、吞噬感光細(xì)胞外節(jié)、吸收可見光及抗氧化應(yīng)激等。RPE細(xì)胞正常生理功能的發(fā)揮需要充足的能量供給,同時也會產(chǎn)生大量的活性氧類(reactive oxygen species,ROS)。RPE細(xì)胞的線粒體是能量產(chǎn)生及ROS清除的關(guān)鍵細(xì)胞器,也是RPE細(xì)胞最先及最易受到損傷的細(xì)胞器。最近研究顯示RPE細(xì)胞線粒體功能障礙與視網(wǎng)膜色素變性的發(fā)生密切相關(guān)。干細(xì)胞來源的RPE細(xì)胞移植是目前治療AMD等致盲性眼病最有前景的治療手段,其治療機(jī)制主要包括:短期的神經(jīng)營養(yǎng)效應(yīng)(by stander效應(yīng))以及長期細(xì)胞替代效應(yīng)(cell replacement)。近來發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞能夠通過線粒體交換改善受者細(xì)胞功能。考慮到AMD等視網(wǎng)膜變性疾病的發(fā)病機(jī)制與RPE細(xì)胞線粒體功能障礙密切相關(guān),有報道顯示RPE細(xì)胞系(ARPE19)間可形成TNT結(jié)構(gòu)并進(jìn)行線粒體交換,目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報答線粒體交換對RPE細(xì)胞功能的影響。本研究主要探索神經(jīng)干細(xì)胞能否與原代分離的LE大鼠和RCS大鼠RPE細(xì)胞形成TNT結(jié)構(gòu)并進(jìn)行線粒體交換,線粒體交換對RPE細(xì)胞能量代謝、ROS代謝和細(xì)胞增殖的影響。初步探討線粒體交換這一機(jī)制是否參與干細(xì)胞治療視網(wǎng)膜變性疾病。方法:第一部分:小鼠神經(jīng)干細(xì)胞與正常RPE細(xì)胞TNT的形成及線粒體交換1.用帶有紅色熒光和綠色熒光的線粒體特應(yīng)性標(biāo)記物(Mitotracker-red,Mitotracker-green)分別標(biāo)記mNSC與ARPE19細(xì)胞后1:1等量直接共培養(yǎng)24 h,于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察TNT的形成及線粒體交換。2.用帶有紅色熒光和綠色熒光的線粒體特應(yīng)性標(biāo)記物(Mitotracker-red,Mitotracker-green)分別標(biāo)記m NSC與原代分離的LE大鼠來源的RPE細(xì)胞后,取等量細(xì)胞1:1直接共培養(yǎng)24h,于激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察線粒體交換。第二部分:小鼠神經(jīng)干細(xì)胞與rcs大鼠rpe細(xì)胞的線粒體交換及其對rpe細(xì)胞功能的影響1.收集單獨(dú)培養(yǎng)的le大鼠來源的原代rpe(le-rpe)、與mnsc等量直接共培養(yǎng)48h后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選所獲得的原代le大鼠rpe細(xì)胞(le-rpe/mnsc),采用高效液相色譜檢測其腺苷酸含量,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞ros水平。2.收集第三代的le大鼠來源的原代rpe細(xì)胞(le-rpe)及rcs大鼠來的源rpe細(xì)胞(rcs-rpe),采用高效液相色譜檢測其腺苷酸含量,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞ros水平。3.收集單獨(dú)培養(yǎng)的rcs大鼠來源的原代rpe細(xì)胞(rcs-rpe)、與mnsc等量直接共培養(yǎng)48h后經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選所獲得的原代rcs大鼠rpe細(xì)胞(rcs-rpe/mnsc),采用高效液相色譜檢測其腺苷酸含量,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞ros水平。結(jié)果:第一部分:小鼠神經(jīng)干細(xì)胞與正常rpe細(xì)胞tnt的形成及線粒體交換1.激光掃描共聚焦顯微鏡下可見mnsc與arpe19細(xì)胞共培養(yǎng)24h后形成tnt,并且mnsc通過tnt將線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)至arpe19中。2.激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察到le大鼠來源的原代rpe(le-rpe)與mnsc間形成tnt,隨著時間的推移,nsc的線粒體通過tnt進(jìn)入le-rpe中。第二部分:小鼠神經(jīng)干細(xì)胞與rcs大鼠rpe細(xì)胞的線粒體交換及其對rpe細(xì)胞功能的影響1.le-rpe與mnsc共培養(yǎng)后atp、adp、amp含量以及腺苷酸池總量及能荷均下降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;共培養(yǎng)組ros水平較未共培養(yǎng)組稍有降低,差異無統(tǒng)計學(xué)意義;共培養(yǎng)組與未共培養(yǎng)組相比g1期的細(xì)胞比例明顯降低,s期及g2/m期細(xì)胞的比例分別增加,細(xì)胞增增殖指數(shù)(pi)也明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明干細(xì)胞能夠通過將線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)至le-rpe細(xì)胞改善其增殖能能力。2.rcs-rpe與le-rpe相比atp、adp、amp含量以及腺苷酸池總量及能荷均下降;rcs-rpe的ros水平高于le-rpe;rcs-rpeg1期的細(xì)胞比例高于le-rpe,S期及G2/M期細(xì)胞的比例分別低于LE-RPE,細(xì)胞增增殖指數(shù)低于LE-RPE。差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明RCS大鼠來源的RPE細(xì)胞存在能量代謝缺陷、抗氧化應(yīng)激能力缺陷和增殖能力下降。3.RCS-RPE與mNSC共培養(yǎng)后ATP、ADP、AMP含量以及腺苷酸池總量及能荷均下降,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義;共培養(yǎng)組ROS水平較未共培養(yǎng)組明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;共培養(yǎng)組與未共培養(yǎng)組相比G1期的細(xì)胞比例明顯降低差異有統(tǒng)計學(xué)意義,S期及G2/M期細(xì)胞的比例分別增加,細(xì)胞增增殖指數(shù)也明顯增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。說明接收了干細(xì)胞的線粒體的RCS-RPE細(xì)胞的線粒體相關(guān)功能得到改善,能量代謝障礙得到糾正。結(jié)論:1.神經(jīng)干細(xì)胞能與ARPE19細(xì)胞株及原代分離的RPE細(xì)胞形成TNT結(jié)構(gòu),并通過TNT進(jìn)行線粒體交換。2.和LE-RPE細(xì)胞相比,RCS-RPE細(xì)胞ATP含量下降、ROS水平顯著升高及細(xì)胞增殖能力下降,說明變性RCS大鼠的RPE細(xì)胞存在能量代謝缺陷、抗氧化應(yīng)激能力和增殖能力的缺陷。RCS大鼠RPE細(xì)胞和小鼠神經(jīng)干細(xì)胞共培養(yǎng)進(jìn)行線粒體交換后,RCS大鼠RPE細(xì)胞的能量代謝、ROS清除及RPE細(xì)胞的增殖能力可得到顯著改善。
【關(guān)鍵詞】：干細(xì)胞 視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞 視網(wǎng)膜色素變性 線粒體 代謝 隧道納米管 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R774
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-15
• 第二章 小鼠神經(jīng)干細(xì)胞與正常RPE細(xì)胞TNT的形成及線粒體交換15-26
• 2.1 引言15
• 2.2 材料和實(shí)驗(yàn)方法15-20
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-24
• 2.4 討論24-25
• 2.5 小結(jié)25-26
• 第三章 小鼠神經(jīng)干細(xì)胞與RCS大鼠RPE細(xì)胞的線粒體交換及對其RPE細(xì)胞功能的影響26-44
• 3.1 引言26
• 3.2 材料和實(shí)驗(yàn)方法26-29
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-41
• 3.4 討論41-43
• 3.5 小結(jié)43-44
• 全文結(jié)論44-45
• 參考文獻(xiàn)45-49
• 文獻(xiàn)綜述 TNT：一種新型細(xì)胞交流機(jī)制49-58
• 參考文獻(xiàn)54-58
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文58-59
• 致謝59

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本文編號：910177