本文關(guān)鍵詞：三七姜揮發(fā)油對人鼻咽癌CNE-2細胞凋亡及周期阻滯作用的研究

  更多相關(guān)文章： 三七姜揮發(fā)油 鼻咽癌 細胞周期阻滯 凋亡 p53

【摘要】：目的:研究三七姜揮發(fā)油誘導人鼻咽癌(CNE-2)細胞凋亡和細胞周期不同時相的分布,從周期調(diào)控的角度觀察細胞周期相關(guān)基因的表達變化,并探討其可能的抑癌機制。方法:1.采用水蒸汽蒸餾法對三七姜干燥根莖進行提取,按照常規(guī)方法分5次進行,收集上層精油,并計算其出油率;2.體外培養(yǎng)人鼻咽癌細胞株(CNE-2),分別用不同濃度(20、40、60、80、120、160、240μg·mL-1)的三七姜揮發(fā)油作用CNE-2細胞24、48、72、96 h后,采用MTT法檢測三七姜揮發(fā)油對CNE-2細胞增殖抑制作用及IC50;3.倒置顯微鏡下觀察CNE-2細胞生長情況;hoechst33258熒光染色觀察不同濃度三七姜揮發(fā)油作用于細胞24 h后細胞凋亡形態(tài)學變化。4.流式細胞術(shù)(FCM)分析三七姜揮發(fā)油處理CNE-2細胞后對細胞凋亡和周期分布的影響;5.采用SYBR Green熒光染料實時熒光定量PCR方法篩查三七姜揮發(fā)油處理的CNE-2細胞中47個細胞周期調(diào)控相關(guān)基因表達譜的變化;6.用Western blot實驗驗證PCR實驗篩選的部分與周期阻滯及凋亡蛋白的表達水平。結(jié)果:1.三七姜干燥根莖經(jīng)水蒸汽蒸餾提取4 h后,分離上層精油,用無水乙醚溶解,加無水硫酸鈉脫水,收集得橘黃色揮發(fā)油,其出油率為3.78%。2.三七姜揮發(fā)油能明顯抑制cne-2細胞增殖及活性,并在一定的時間及濃度范圍內(nèi)(20、40、60、80、120、160、240μg·ml-1),抑制率呈明顯的時間-劑量依賴性,其ic50分別為71.12,60.03,53.17,34.75μg·ml-1;3.倒置顯微鏡下觀察,隨著加藥濃度的增大,細胞增殖緩慢,部分細胞變圓、皺縮;高倍鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)黑色碎顆粒物質(zhì)增多,細胞膜彎曲可見壞死細胞及碎片;熒光顯微鏡可見凋亡細胞核的改變,呈致密濃染的強藍色熒光,形成凋亡小體;當加藥質(zhì)量濃度達到100μg·ml-1時,鏡下幾乎很少能找到完整的細胞核,染色質(zhì)逐步分裂為碎片;4.流式細胞術(shù)(fcm)顯示經(jīng)不同濃度的三七姜揮發(fā)油處理cne-2細胞24、48、72、96h后,annexinv/pi雙染法提示三七姜揮發(fā)油能誘導cne-2細胞凋亡;pi單染法發(fā)現(xiàn)三七姜揮發(fā)油能使cne-2細胞停滯于g1期,呈劑量-時間依賴關(guān)系;5.實時熒光定量pcr法檢測細胞周期調(diào)控相關(guān)基因表達譜發(fā)現(xiàn),三七姜揮發(fā)油處理cne-2細胞24h后,與對照組比較,tp53、cdkn1a(p21)、cdkn1b(p27)、cdkn3、caspase-3、gadd45a等6個基因的mrna水平普遍升高,當加藥質(zhì)量濃度達到100μg·ml-1時,差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);e2f1、atm、skp2、ccnd1、cdk6、cdc34、cdc25a、ccne1、cul1、abl1、cdc6、mcm3、mcm4、wee1、bcl-2、mdm2、ccna2、ccnb1、ccnb2、ccnd2、rad17、hus1等基因mrna表達水平呈不同程度的下降;6.westernblot結(jié)果顯示,采用不同加藥質(zhì)量濃度三七姜揮發(fā)油(0、40、80、100、120μg·ml-1)處理cne-2細胞24h,對pcr篩選出的特異性表達的細胞周期調(diào)控相關(guān)基因進行檢測,與對照組相比,加藥處理組p53、p21、pparγ、caspase-3蛋白表達量增加,cyclind1與bcl-2表達下調(diào);當加藥質(zhì)量濃度達到80μg·ml-1時,差異有統(tǒng)計學意義(p0.01)。結(jié)論:三七姜揮發(fā)油對人鼻咽癌CNE-2細胞有明顯的生長抑制作用,呈劑量-時間依賴性,并通過誘導細胞周期阻滯及凋亡發(fā)揮抗鼻咽癌作用,其機制可能涉及p53依賴性途徑及干擾DNA損傷修復的ATM-Chk2-Cdc25A通路等信號調(diào)控網(wǎng)絡。因此,三七姜揮發(fā)油可能在治療鼻咽癌方面有巨大潛力。
【關(guān)鍵詞】：三七姜揮發(fā)油 鼻咽癌 細胞周期阻滯 凋亡 p53
【學位授予單位】：桂林醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.63
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• ABSTRACT7-11
• 英漢縮略詞對照表11-12
• 前言12-19
• 1 材料與方法19-42
• 1.1 實驗材料與試劑19-21
• 1.2 主要實驗儀器21-22
• 1.3 實驗準備22-23
• 1.4 主要實驗試劑的配制和準備23-26
• 1.5 實驗方法26-42
• 2 結(jié)果42-57
• 2.1 三七姜揮發(fā)油對鼻咽癌CNE-2 細胞增殖抑制作用42-43
• 2.2 三七姜揮發(fā)油對CNE-2 細胞形態(tài)學觀察43-45
• 2.3 流式細胞術(shù)分析三七姜揮發(fā)油對鼻咽癌CNE-2 細胞凋亡的影響45-47
• 2.4 流式細胞術(shù)分析三七姜揮發(fā)油對鼻咽癌CNE-2 細胞周期的影響47-49
• 2.5 實時熒光定量PCR檢測細胞周期調(diào)控相關(guān)基因的表達49-55
• 2.6 Western Blot檢測相關(guān)蛋白的表達55-57
• 3 討論57-63
• 4 結(jié)論63-64
• 參考文獻64-73
• 綜述73-84
• 參考文獻80-84
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術(shù)論文目錄84-85
• 致謝85-87

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 孫曉杰;黃常志;;PI3K-Akt信號通路與腫瘤[J];世界華人消化雜志;2006年03期

中國博士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 張東輝;雜色曲霉素誘導人胃黏膜上皮細胞(GES-1)G_2期阻滯及凋亡可能分子機制的研究[D];河北醫(yī)科大學;2011年

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本文編號：858553